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1、,1.2 基因工程的基本操作程序,知识回顾：,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的获取,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编
2、码区,非编码区,调控遗传信息表达,上 游有RNA聚合酶结合位点:,基因结构,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。,与RNA聚合酶结合位点,基因结构,1. 从基因文库中获取目的基因,1. 基因文库的概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,2. 基因文库的种类:,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基
3、因， 如：cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,受体菌群体,与运载体连接导入,cDNA文库,某种生物某个时期的mRNA,真核细胞的cDNA的获取,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码序列。即不含非编码区和内含子,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,怎样从基因文库中找到
4、我们所需要的目的基因,根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。,2.利用PCR技术扩增目的基因,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,PCR技术的操作过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,变性,1.目的基因D
5、NA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。,过程：,PCR技术的操作过程,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋变复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等,PCR技术扩增过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下
6、， 断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,3. 人工合成法,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,人工合成法（真核生物）,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推测
7、,推测,单链DNA,合成,课堂小结,目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,二、基因表达载体的构建核心,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,
8、一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,表达载体,过程:,基因表达载体的构建基因工程的核心,1、目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止m
9、RNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,三、将目的基因导入受体细胞,1、目的基因导入植物细胞的方法,（1）农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳
10、定维持和表达,过程：,1、目的基因导入植物细胞的方法,（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞,操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。, 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。,适用：单子叶植物,1、目的基因导入植物细胞的方法,（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞, 特点:十分简便经济。,例：转基因抗虫棉,2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序,目的基因
11、表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态 细胞,感受态细胞 吸收DNA,表达载体与感受态细胞混合,小结：将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,1,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,1、鉴定分子水平的鉴定,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14
12、N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,1、鉴定分子水平的鉴定,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,14N,1、鉴定分子水平的鉴定,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,2、鉴定个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中
13、毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等,个体水平的鉴定,目的基因的表达和检测,课堂练习,1、有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,课堂练习,2、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,【拓展深化】只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对,课堂练习,即时应用(随学随练，轻松夺冠)3(2009年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达,D,
