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1、基因工程的基本操作程序,知识点一：1原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因首端是RNA聚合酶识别和结合的部位并能驱动基因转录出mRNA。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控序列，最重要的是RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游
2、,启动子,终止子,编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,知识点一：2真核细胞的基因结构,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质内含子：不能编码蛋白质的序列,与原核细胞相同,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,1目的基因的获取,2基因表达载体的构建,3将目的基因导入受体细胞,4目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,目的基因的获取,阅读课本第一自然段，回答以下问题：,2获取目的基因的常用方法有哪些？,（1）从基因文库中获取,（2
3、）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,1什么叫目的基因？并举例说明。,主要是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子,（一）从基因文库中获取目的基因,1.基因文库：概念见课本,2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,3.基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,4.基因文库的构建方法,（1）直接分离法,单链互补DNA,双链cD
4、NA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,（2）反转录法：cDNA的合成流程图解,某种生物的单链mRNA,思考：基因组文库和部分基因文库（如cDNA）的关系？2基因组文库和cDNA文库的比较3如何从基因文库中得到所需要的目的基因？,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,2利用PCR扩增目的基因（阅读课本第10页回答问题）,（1）RCR 的中文全称？PCR是一项什么样的技术？（2）PCR原理？利用这一技术获取目的基因的前提？（3）PCR的过程？这一过程利用了什么酶？（4）通过PCR使目的基因的数目如何增长？,
5、概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：,原理：,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,指数,2n,在短时间内大量扩增目的基因,前提：,要有一段已知目的基因的核苷酸序列,一对引物、,模板DNA（含目的基因）,过程：,ADNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,B退火（复性55-65）：系统温度降低， 引物与DNA模板结合，形成局部_。,C延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,5
6、/,3/,GG,TC,变性,1变性(9095 )：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2复性（5560 ）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3延伸（7075 ）：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链,（二)利用PC(R技术扩增目的基因,PCR技术扩增与DNA复制的比较,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,(二)利用PCR技术扩增目的基因,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA(即
7、目的基因),反转录,合成,1反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,2根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,（三）人工合成的目的基因,小结,目的基因的获取,目的基因的定义,常用方法,从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,人工合成,基因组文库,部分基因文库,原理、条件,方式、结果,过程,二、基因表达载体的构建, 核心,1如何构建基因表达载体？2基因表达载体构建的目的？3基因表达载体的组成？4启动子、终止子、标记基因的作用分别是？,读教材回答以下问题,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出2.用_切
8、断目 的基因，使其产生, 核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端平末端,同一种限制酶,切口,DNA连接酶,二基因表达载体的构建,相同的黏,末端平末端。,基因表达载体的组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,目的：,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从
9、而将有目的基因的细胞筛选出来,通读教材回答问题1转化的概念2将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法分别有哪些？,三、将目的基因导入受体细胞,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细
10、胞染色体的DNA上。,仔细阅读课本将目的基因导入植物细胞（1）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是？（2）农杆菌如何感染植物细胞？（3）农杆菌的Ti质粒中有何特点？（4）若用农杆菌转化法应选用什么作为运载体？将目的基因插入运载体的什么部位？此时的农杆菌是受体细胞吗？（5）获得含有目的基因的受体细胞后如何获得具有新性状的植物体？原理？（6）农杆菌转化法和基因枪法分别适用于什么生物？,过程：,优点：稳定、经济、有效,将外源目的基因插入Ti质粒的T-DNA中形成重组Ti质粒,将重组Ti质粒转入农杆菌,使含重组Ti质粒的农杆菌感染植物细胞,含目的基因的植物细胞,表现出新性状的植株,（2）基因枪法（3
11、）花粉管通道法,2将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,3将目的基因导入微生物细胞阅读课本：早期基因工程为何选择原核生物作为受体细胞？方法？原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,1获取目的基因的常用方法、PCR技术的原理、条件、过程、方式、结果。2人工合成目的基因的方法及过程。3构建基因表达载体的目的、基因表达载体的组成及各组成部分的作用。4基因表达载体的构建过程？将目的基因导入植物、动物、微生物细胞的方法分别是什么？5农杆菌
12、转化法的原理（即Ti质粒的T-DNA的作用特点）、适用范围。6叙述用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞的过程。,复习（15分钟后黑板展示）,阅读课本：目的基因的检测与鉴定,目的基因检测的过程分为哪几步？分别用什么方法？鉴定（个体生物学水平）方法？,四、目的基因的检测与鉴定,检测（分子检测）,鉴定（个体生物学水平）,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,检查是否成功,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插 入了目的基因,检测转基因生物染色体的DNA上是否插了目的基因,过程:A首先取出转基因生物的基因组DNA。B对含目的基因的DNA片段作放
13、射性同位素标记，以此做探针。C使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中。,方法:,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,目的基因的检测示意图,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA.,鉴定,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说
14、明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,思考：若培育耐盐碱的水稻，如何鉴定？,归纳： 基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：,学以致用,若用Bt毒蛋白基因作为目的基因培育转基因抗虫棉，可用什么方法？叙述培育过程！,练习：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（）获得耐盐基因后，构建重组DN
15、A分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,a,a,（）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。（）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,脱分化和再分化,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌,练习：继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入中，原因（3）通常采用_技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的_细胞中特异表达。,显微注射,受精卵,受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因,DNA分子杂交,膀胱上皮,（或早期胚胎）,在相应的组织细胞中表达。,
