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2、组技术的基本工具 1.基因工程的概念DNA重组技术,归纳整合,一、基因工程的概念,归纳整合 一、基因工程的概念基因工程的别名基因拼接技术或DN,2.基因工程的基本工具(1)“分子手术刀” _来源：主要是从_中分离纯化出来的。功能：能够识别双链DNA分子的某种_的核苷酸序列，并且使每一条链中_部位的两个核苷酸之间的_断开，因此具有_性。结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：_和_。,专一,限制性核酸内切酶（限制酶）,原核生物,特定,特定,磷酸二酯键,黏性末端,平末端,2.基因工程的基本工具专一 限制性核酸内切酶（限制酶）原核生,(2)“分子缝合针”_两种DNA连接酶（大肠杆菌DN
3、A连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：a.相同点：都缝合_键。b.区别：大肠杆菌DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的_之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合_。与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将_加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接_的末端，形成磷酸二酯键。,DNA连接酶,磷酸二酯,黏性末端,两种末端,单个核苷酸,两个DNA片段,(2)“分子缝合针”_DNA连接酶 磷,(3)“分子运输车”_运载体具备的条件a.能在受体细胞中复制并稳定保存。b.具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。c.具有标记基因，供重组DNA的鉴定。最常用的运载体是_
4、,它是一种裸露的、结构简单的、独立于_核区DNA之外，并具有_的双链_DNA分子。其他运载体：_、_。,动植物病毒,载体,质粒,细菌,自我复制能力,环状,噬菌体,(3)“分子运输车”_动植物病毒载体质,运载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到运载体上去。运载体DNA必须具备自我复制能力，或可以整合到受体染色体DNA上随受体染色体DNA的复制而同步复制。运载体DNA必须带有标记基因，以便重组后进行重组分子的筛选。,运载体,运载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因,考点一基因工程的基本工具一、与DNA分子相关的酶,种类限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋
5、酶作用,解旋酶：该酶能在DNA复制或转录时破坏DNA碱基对间的氢键，从而将双螺旋打开。DNA水解酶：该酶能催化DNA水解。RNA聚合酶：该酶能在转录时将单个的核糖核苷酸连接成RNA单链。限制酶：该酶的作用是识别特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。,区分以下几种酶,解旋酶：该酶能在DNA复制或转录时破坏DNA碱基对间的氢键,注 ：用限制酶切割DNA分子时，被破坏的是DNA链中的磷酸二酯键（即连接相邻两个脱氧核苷酸的键）。 黏性末端是指双链DNA分子被限制酶切开后，切口处的两个末端伸出的由若干特定核苷酸组成的单链。,注 ：用限制酶切割DNA分子时，被破坏的是DNA链中的磷酸,DNA连接
6、酶,DNA连接酶,跟踪训练,（2008 年全国卷）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（ ）A.3 B.4 C.9 D.12,C,跟踪训练（2008 年全国卷）已知某种限制性内切酶在一线性,解析：从这三个切点进行酶切，可得到片段种类有四种（即a、b、c、d四种）；从其中二个切点进行酶切，可得到不同于前
7、面的片段种类有三种（即a+b、b+c、c+d三种）；只有一个切点时，得到不同于前面的片段种类有二种（即a+b+c、b+c+d二种）。故最多能产生片段种类数为4+3+2=9种。,解析：从这三个切点进行酶切，可得到片段种类有,考点二基因工程基本操作程序分析一、目的基因的获取途径1从基因组文库中获取。2人工合成目的基因常用的方法有：(1)已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。(2)以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。3PCR技术扩增目的基因,考点二基因工程基本操作程序分析,(3)PCR技术扩增目的基因原理：_。过程第一步：变性：_；第二步：复性：引物结合到互
8、补DNA链；第三步：延伸：在热稳定DNA聚合酶作用下，从引物起始合成互补链。2.基因表达运载体的构建(1)目的：使目的基因在受体细胞中_，并且可以_，使目的基因能够_。(2)组成：_,DNA解链,DNA复制,标记基因,稳定存在,遗传至下一代,表达和发挥作用,目的基因,启动子,终止子,(3)PCR技术扩增目的基因DNA解链 DNA复制标记基因,PCR技术DNA复制相原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料,基础梳理,基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达运载体的构建、将目的基因导入受体细胞及目的基因的表达与检测等四个步骤。1.目的基因的获取(1)目的基因：_。(2)原核基因采取_获得
9、，真核基因通过_获得。人工合成目的基因的常用方法有_和_。,编码蛋白质的结构基因,直接分离,人工合成,反转录法,化学合成法,基因工程的基本操作程序 基础梳理基因工程的基本操作程序包括：,启动子：是一段有特殊结构的_，位于基因的_，是_识别和结合的部位，能驱动基因转录出_，最终获得所需的_。终止子：也是一段有特殊结构的_，位于基因的_。标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是_。,DNA片段,首端,RNA聚合酶,mRNA,蛋白质,DNA片段,尾端,抗生素抗性基因,启动子：是一段有特殊结构的_，位于基因的,三、将目的基因导入受体细胞,
10、三、将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞,3.将目的基因导入受体细胞(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)常用的转化方法将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是_，其次还有_和_等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是_。此方法的受体细胞多是_。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是_，最常用的原核细胞是_。其转化方法是：先用_处理细胞，使其成为_，再将重组表达运载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射技术
11、,受精卵,繁殖快、多为单细胞,大肠杆菌,Ca2+,感受态细胞,3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显,4.目的基因的检测与鉴定(1)首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用_。(2)其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用_。(3)最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行_。(4)有时还需进行_的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。,个体生物学水平,DNA分子杂交技术,用标记的目的基因作探针与mRNA杂交,抗原抗体杂交,个体生物学水平DNA分子杂交技术用标记的目的基因作探针与mR,植物转基
12、因过程,原生质体,植物转基因过程原生质体,DNA分子杂交技术,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转移至硝酸纤维素膜上,与放射性标记DNA探针杂交,放射自显影,带有DNA片段的凝胶,凝胶,滤膜,用缓冲液转移DNA,吸附有DNA片段的膜,探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。,DNA分子杂交技术DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转,归纳整合,一、外显子与内含子一般来说，真核生物的结构基因都是由外显子和内含子组成,归纳整合 一、外显子与内含子,二、原核细胞与真核细胞的基因结构的比较,原核细
13、胞的基因真核细胞的基因不同点编码区连续；结构简单编码区,基础梳理,1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的_。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产_。3.基因治疗：_导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。,把正常的外源基因,品质,药物,基因工程的应用 基础梳理1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转,归纳整合,一、基因诊断与基因治疗,1.基因诊断(1)原理：DNA分子杂交。(2)过程：制备用放射性同位素（如32P）、荧光分子等标记的DNA（患者DNA）分子作探针；将待测DNA制成单链；让两者进行杂交，若两者能进行互补配对，则说明患有此病，
14、否则不患此病。2.基因治疗(1)原理：把正常的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。病人细胞中既有缺陷基因，也有正常基因。,归纳整合一、基因诊断与基因治疗1.基因诊断,二、 植物基因工程与动物基因工程的成果,二、 植物基因工程与动物基因工程的成果外源基因类型及举例成果,外源基因类型及举例成果举例改良品质的转基因植物优良性状基因：,外源基因类型及举例成果举例生产药物的转基因动物药用蛋白基因+,跟踪训练,（2009 年安徽卷）2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物
15、细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是（ ）A.追踪目的基因在细胞内的复制过程B.追踪目的基因插入到染色体上的位置C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布D.追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构,C,跟踪训练（2009 年安徽卷）2008年诺贝尔化学奖授予了“,基础梳理,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过_或_，对现有蛋白质进行_，或制造一种_，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产_的蛋白质）,自然界已存在,基因修饰,基因合成,改造,新的蛋白质,基础梳理蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关
16、,归纳整合,一、蛋白质工程1.蛋白质工程的目的：生产符合人们生活需要的并非自然界已存在的蛋白质。2.蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定要求，对蛋白质基本结构进行分子设计。由于基因决定蛋白质，因此，要对蛋白质结构进行设计改造，还必须从基因入手。3.蛋白质工程的流程图预期功能蛋白质三维结构氨基酸序列（多肽链）基因具有预期功能的蛋白质,归纳整合一、蛋白质工程,跟踪训练,科学家将干扰素基因进行定点突变导入大肠杆菌表达，使干扰素第17位的半胱氨酸改变成丝氨酸，结果大大提高干扰素的抗病性活性，并且提高了储存稳定性，该生物技术为（ ） A.基因工程 B.蛋白质工程 C.基因突变
17、 D.细胞工程,B,跟踪训练科学家将干扰素基因进行定点突变导入大肠杆菌表达，使,热点聚焦,热点聚焦,（2009 年江苏卷）苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。,基因工程的应用 （2,高三一轮复习：基因工程正式幻灯片课件,(1)将图中的DNA用Hind 、BamH 完全酶切后，反应管中有_种DNA片段。(2)图中表示Hind 与BamH酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_种重组质粒；如果换用Bst 与BamH 酶切，目的基因与质粒连接后可获得_种重组质粒。(3)目的基因插入质粒后，不
18、能影响质粒的_。(4)图中的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的T-DNA导人植物细胞，并防止植物细胞中_对T-DNA的降解。,4,1,2,复制,DNA水解酶,(1)将图中的DNA用Hind 、BamH 完全酶切后,(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞_。 (6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的_基因频率的增长速率。,表面无相应的特异性受体,抗性,(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的,获取目的基因,获取目的基因,2.目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）,2.目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）,
