PCR培训教材(DOC9页).doc

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1、标准的PCR实验室简介设计规划1、 主体结构：主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。2、 标准的三区分隔和气压调节：将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区， 同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区，缓冲区和 PCR 扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。3、 消

2、毒：在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。4、 机械连锁不锈钢传递窗：试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。5、 地面地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面，或大块的瓷砖（至少800mm800mm）接缝需要小于2mm。6、 照明灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。在建设的过程中应注意：规范的安装流程和全面的服务流程。严格按照规范科学设计的安装流程。安

3、装前需要确定以下安装条件，如：电源电压，电源进线位置，电话网络线进线位置，进水水压，最小安装空间，地面平整度，通风孔、进水管和下水管的位置等，理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。实验室平面布局示意图注：（1）试剂准备和标本制备区之间、标本制备和扩增区之间各有一传递窗传递试剂等物品，根据人物分流原则，实验人员由缓冲间经内走廊单向走入下一区间。非实验室工作人员不得进入内走廊。 （2）三个区均配备独立空调。试剂准备区和标本制备区均由外向内排风，保持室内正压。扩增区由内向外抽风，保持室内负压。 （3）三个区间配备移动紫外灯各一台。PCR装机培训一、 装机前准备1、 询问需装机单位是否有移液器（必须有的量称

4、为2ul、25ul、100ul、200ul等）、加热装置(杭州奥盛干浴锅温度必须达到100)、台式高速离心机（转速必须达到13000rpm）、低速离心机分离血清（转速必须达到3500rpm以上）、震荡混匀器。最好再配掌式离心机（用于将管壁上液体甩到管底）否则只能用手甩。2、 自带物品：移液器tip头（200ul的黄枪头和10ul的小枪头）、薄膜手套、乳胶手套、0.5ml离心管、1.5ml离心管、离心管架。如有必要可自带移液器，规格分别为：0.5-10ul、5-50ul、20-200ul、100-1000ul。3、 如果要自带试剂，一定要领取乙肝（HBV）荧光定量核酸检测试剂盒（罗氏专用试剂盒）

5、，还要配套带好免抽提标准品（两盒试剂配一套免抽提标准品）。4、 清点设备：PCR仪一台、电脑主机一台、电脑显示器一台、打印机一台。二、 路上注意事项1、 PCR仪一定要小心轻放、保持正面向上，千万不能倒置。2、 如果携带试剂盒，要在泡沫箱中放入冰袋，保持低温保存。三、 装机1、 查看场地，PCR实验室最好能分为三个：样本处理（加样）室、反应液配制室、扩增室。2、 将电脑显示器、主机、打印机和PCR仪连接好，查看是否可正常运行。3、 将装有试剂盒的泡沫箱打开，把试剂盒以及免抽提的标准品存放入-20的冰箱，如马上使用，可存放在4的冰箱待用。四、 实验（一）标本处理：在样本处理室进行，处理标本时需要

6、戴乳胶手套。1、 打开加热装置，把预设温度调到100。2、 标本由装机单位提供，可选取阳性和阴性标本各一、二个。3、 在离心管架上排上所需数目的0.5ml或1.5ml离心管待用。4、 打开试剂盒，取出标本处理液A和B，将两者分别混匀待用。5、 在每一个离心管中加入100ul标本处理液A，然后再逐一加入血清液100ul（每一个都要换枪头），盖上盖子，做好标记，在震荡器上震荡混匀（若没有振荡器可人工颠倒混匀，并用手指弹打数次）。6、 放入台式高速离心机中，13000rpm离心10分钟。注意：在离心时必须保持离心管的平衡，离心机有内盖的要盖内盖。离心管的放置必须保持管背突出部分一致向外，以便在吸取上

7、清液时不带走所需的核酸片断。7、 离心完成后，小心取出离心管，尽量少震动，防止核酸片断从底部被带起，轻轻打开离心管，从离心管腹部开始慢慢吸取上清液，不要碰到底部和外侧部的核酸片断，尽量一次性把200ul的上清夜吸干净，若不行也可分两次进行，但不要反复吸打，以避免核酸片断被带起。（吸取上清液时，离心管按从离心机取出的方向倾斜，移液枪头斜向插入离心管底部，吸出的200ul上清液是不用的）8、 在离心管中加入标本处理液B 25ul（在加的时候注意枪头不要碰到离心管的管壁，以免交叉污染），用震荡器充分混匀，低速离心数秒，放入加热装置中，100加热10分钟，取出放入台式高速离心机中，13000rpm离心

8、10分钟。9、 上清液（此上清液指的是第8步配成的液体）作为模板待用。10、 若要用试剂盒中的标准品，则与标本相同处理。（二）反应液的配制：在反应液配制室进行，戴薄膜手套，以避免乳胶手套上的荧光粉粘在毛细管上，影响荧光的读取。1、 取出试剂盒中的反应液A（蓝色）B（绿色）C（棕色），待完全溶化后，分别混匀后，低速离心数秒，待用。2、 在干净的离心管中按一人份比例为A:B:C=9:8:1的比例（即一人份，反应液A 9ul、B 8ul、C 1ul）配制反应液，配制时一般要求多配制一人份（即n+1人份），充分混匀后，按每一管18ul量，分装于毛细管上面开口的底部。（干净离心管的大小按实际配制量自行调

9、整，可用0.5ml的或1.5ml的）（三）加模版：在标本处理室进行，戴薄膜手套。1、 将免抽提的标准品取出，完全溶化后，充分混匀，低速离心数秒，待用。2、 将标本和免抽提标准品（或抽提好的标准品）按每个2ul 逐一加入毛细管开口底部的反应液中（一定要加到反应液中，不可挂壁，以防止两者没有混融，造成实验失败），每一个都要换枪头。3、 每一次实验都要带四个标准品（107、106、105、104）和一个阴性（阴性对照液也包括在试剂盒中）。4、 用圆头镊子逐一将每一个毛细管的盖子盖好，不要用尖头的镊子，以免把毛细管的盖子顶穿。5、 把毛细管放入离心架上，将离心管架放入离心机中，低速离心数秒（不要超过3

10、000rpm，以防毛细管断掉）。6、 将毛细管取出，上机。注意事项：1、所有的试剂和反应液(A试剂、B试剂、C反应液)都要在振荡器上单独混匀。2、奇数的试管要加一根200ul水的子弹头变成偶数配平后均衡放入离心机后离心，以免不平衡。3、100干浴锅孵育时间10分钟+3分钟，孵育时可打开锅盖以免爆子弹头瓶盖。4、高速离心机速度13000转(可设15000转)，时间可适当延长10分钟。5、放入高速离心机时，记住子弹头的统一放置方向，抽提上清液时，将移液器的量调至205ul，枪头朝离心反方向的底部倾斜抽提。6、毛细管盖上盖子后低速离心数秒，插入仪器时往下按一下。上海科华(Fluo Cycle型)仪器

11、操作程序1.目 的 保证上海科华(FluoCycle型)核酸扩增荧光定量检测仪的正确和正常使用。2.适用范围 本规程适用于上海科华(FluoCycle型)荧光定量PCR仪分析的所有实验过程。3.制定依据 上海科华(FluoCycle型)仪器操作使用说明书。4.职 责 由经培训合格的临床基因扩增实验室技术人员操作仪器。5.准备工作5.1打开计算机，键入用户名和密码登录；5.2打开FluoCycle机器电源开关；5.3在桌面或Windows开始菜单中点击pcrsoftware1图标，进入FluoCycle软件主界面；5.4点击“编辑运行” 进入样品信息设置界面，稍后屏幕提示“是否现在开始自检？”对

12、话框；选择“Yes”，机器即进入自检；选择“No”，机器即跳过自检。自检结束后，屏幕显示“自检通过”，点击“OK”后，进入样品设置界面；机器只需在每天第一次实验前自检一次，自检：空卡盘(未插入毛细管的样品盘)放在机器中，放下盖子，点击“Yes”进行自检；如果自检结果显示“错误”，则记下报错信息，并与科华公司技术服务部联系。6.编辑样品信息6.1 在样品信息设置界面,点击“新建文件”,新建一个实验项目；6.2 “输入检测样品总数”后“回车”,编辑样品信息.也可在仪器运行过程中点击“编辑样品”编辑，或运行结束后再进入样品信息设置界面更改，但样品个数在仪器运行后不能再修改；在“类型”中可选“未知”（

13、样品）、“标准”和“阴性”，每次实验一般都带标准和阴性做（阴性是必须带的，去除工作液受到污染的影响，除非保证实验室完全无污染），标准的已知浓度根据试剂标准说明书上的值输入（譬如3E7、3E6、3E5、3E4、3E3），阴性的已知浓度为0.000E+0，项目名称可单独输入也可整体输入。6.3 点击“打开文件”,可对已有项目进行编辑；6.3 点击“清除输入”可清楚输入信息重新填写；6.4点击“保存修改”将保存输入的样品信息；6.5点击“运行”，仪器开始样品找位，并进入温度设置界面。7.设置实验参数7.1点击“新建参数”， 按试剂说明书要求设定实验循环参数；编辑循环参数时,只要输入“第一目标温度”、

14、“温度保持时间”、“采样方式”和“循环次数”譬如4步循环（机器自带，可以直接打开参数调用，文件存在C:Program Filespcrsoftwareexp目录下的KHB文件） 右下框的名称 第一目标温度 温度保持时间 采样方式 循环次数1 、(预热1) 50 120S 不采样 12、 (预热2) 93 120S 不采样 13、 (采样) 93 10S 不采样 40 60 30S 采样4、 (散热) 40 10S 不采样 1注：第三步循环中的第一阶段温度保持时间10S是正确的，试剂说明书上写的3S是错误的。7.2参数设置完毕后，点击“保存参数”；7.3 对已保存的实验参数，点击“打开参数”即可

15、调用；7.4 样品找位结束后，点击“运行”进入运行界面，开始检测，此时禁止打开盖子。实验程序运行界面结构：上方为荧光实时显示图：显示每个样本实时荧光值，记录每个样本荧光值变化趋势；下方为温度实时显示图：显示运行过程中的实际温度值；若温度实时显示图显示的波形不是规则的或不均匀的，说明仪器的温度控制部件有故障；若荧光实时显示图显示的波形不是正常的图形，很可能是光路对位置光偶有问题。发射波长是470，接收滤光片的波长F1/530、F2/640、F3/710（平时只用F1/530单波长）。7.5完成运行后，软件自动保存数据，转入FluoCycle数据分析主界面。8.数据分析8.1仪器运行结束后，进入数

16、据分析界面，软件自动加载当前的实验数据，也可点击左下角“打开文件”打开一个已经有的实验，进行离线的分析；8.2仪器提供“方差法”和“最小二乘法”两种数据分析方法；8.3方差法分析：选择方差法，设置起始点（默认3）、终止点（默认8）和系数（默认1.2），点击红色按钮“方差法分析”，直到得到较好的结果； 起始点和终止点都是指横坐标循环次数第几次对应的荧光值，适当修改起始点、终止点和加大系数值相当于向上拉动“噪声带设置框”、提高CT阈值。8.4最小二乘法分析：选择最小二乘法，显示方式选择“log”，拉动“噪声带设置框”的噪声带设置线（图中黑色的水平线），按住鼠标左键，上下移动基线，至刚刚覆盖阴性对照

17、正常扩增曲线顶部位置/且正好所有曲线都处在刚好开始均匀规则的上升处，且阴性对照CT值为零，点击按钮“最小化误差”，得到各标本的检测结果；或者拉动CT阈值设置框中的黑色水平线设置阈值，但阈值只能在噪声带以上位置移动（经验丰富的操作者，可不用拉动“噪声带设置框”的黑色水平线，直接拉动CT阈值黑色水平线到正好所有曲线都处在刚好开始均匀规则的上升处设置阈值，然后点击“CT值分析”即可）；8.5选择任何一种分析方法，软件均可自动地计算CT，绘出标准曲线和相关系数r，并计算样品浓度值。8.6分析完毕后，点击“保存结果”，否则打印报告时仪器自动读取调整前的默认数据。注：完成后进行数据分析，若实验结果中由标准

18、品求得的标准线较好(相关系数不小于实验规定数据/非常接近-1.000，标准样本点几乎都在标准直线上)时 ，也可不用做调整。标准曲线的创立：结果分析完成后，点击“保存标准”，在弹出的对话框点击保存创立并保存本次实验的标准线。大部分情况下相信仪器通过方差法自动测得的值，不用执行最小二乘法分析操作。标准曲线的调用：在数据分析界面，点击“调用标准”，仪器提示“将调用已有标准曲线进行分析，但不保证计算结果的准确性！”，点击“ok”, 在弹出的对话框中选择要导入的标准曲线，点击“ok”打开导入,实验数据由软件自动分析得出。 9.打印报告9.1在数据分析界面或主界面，点击“打印报告”，进入打印界面；9.2选

19、择要编辑的样品，点击“病人信息设置”，在跳出的对话框中输入病人信息，点击“保存修改”；9.3选择要打印的样品，点击“打印检验报告”，即可打印病人报告；9.4点击“打印检验报表”，可打印综合检验报告。10结束工作10.1确认实验结束后，关闭FluoCycle软件；10.2关闭主机的电源；10.3关闭计算机系统；10.4取出样品盘，用退管器取出毛细管，按照有关规定处理用过的毛细管；10.5清理操作台面。上海科华(FluoCycle型)荧光定量PCR仪维护保养程序1.目 的 本规程决定了荧光定量PCR仪保养方法，以确保仪器正常运行，结果准确规范。2.适用范围 本规程适用于上海科华FluoCycle型

20、荧光定量PCR仪分析的所有试验过程。3.制定依据 上海科华FluoCycle型荧光定量PCR仪使用说明书。4.职 责 由经培训合格的临床基因扩增实验室技术人员操作仪器。5.维护方法：5.1 每天使用结束后，用干净软布清洁机器表面尘土；5.2 每周用镜头纸清洁检测窗口一次；5.3 如果发生毛细管破裂情况，可先用10%次氯酸钠浸泡的棉签对样品盘及机器内外壁消毒，再用蒸馏水或70乙醇浸泡的棉签清洁；注意事项：a)记好操作记录。b)非本室人员使用该仪器，需在本室人员的指导下操作。关机前，应由本室人员检查仪器是否正常方可关机。操作人员和本室人员同时签字。不可自行挪动仪器，不可自行拆开仪器间接口。注：该仪

21、器由厂家每年定期校准维护。上海科华(FluoCycle型)荧光定量PCR仪校准程序1.目 的 保证循环仪温控的精确度。2.适用范围 FluoCycle荧光定量PCR仪。3.职 责 本SOP由实验室负责人执行落实。4.操作程序4.1 新安装的仪器以生产厂商的合格证明为校准依据。4.2 循环仪每1年由厂商对其温控系统进行校准1次。4.3 仪器使用过程中如发现温度有漂移或怀疑实验结果不理想的可能原因是循环仪时，应及时与厂商联系对仪器进行校准。4.4 仪器故障维修后应对仪器进行校准合格后方可使用。4.5 做好仪器的校准记录。附：注意事项a）仪器应放置在水平坚固的平台上，外界电源系统电压要匹配，并要求有

22、良好的接地线。b）环境温度保持在23左右，湿度保持在60左右。对于潮湿的省份，推荐配备除湿机。c）仪器应配备合适的UPS或稳压器。e）仪器使用时应严格遵守上述使用步骤。Fluocycle实时荧光PCR仪加热丝更换说明书一、准备工具：1、内六角扳手（3#）一把。2、十字螺丝刀一把。3、小型平头螺丝刀一把。二、更换步骤：1、 切断仪器电源开关。2、 等仪器冷却后，打开仪器盖子，拆去上盖外围三颗内六角螺丝，将帽子拿下，见下图。内六角螺丝3颗3、 松开接线柱上连接加热丝导线的两颗一字螺丝，将导线轻轻取出，拆去加热腔上面固定加热丝的两颗十字螺丝，见下图十字螺丝2颗一字螺丝2颗4、 抓住导线将加热丝从加热腔垂直拿出，小心不要将腔内壁的绝缘片带出或划破。5、 将备用加热丝原样垂直装回。注意：加热腔内壁贴有绝缘片，安装时请保证绝缘片紧贴腔体内壁。6、 确定加热丝已安放后，旋紧固定螺丝，再将导线固定到接线柱上。7、 上盖帽子原样安放好，先将三颗内六角螺丝分别旋上，在确定三颗螺丝都旋上后，均匀将螺丝旋紧。8、 更换完毕。