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1、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局 The Chemical Laboratory of AHCIQ 标准操作程序Standard Operation Procedure液相色谱岗位分析方法性能标准、其他要求和步骤Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results at LC PostTimes new roman小二号居中方法编号SOP-LC-XXX批准人起草人版本/版次签发人修订次数签发日期验证人实施日期验证日期安徽出入境检验检疫局化学技术中心液相色谱岗位分析方法性能标准、其他
2、要求和步骤1定义1.1 准确度检测结果与可接受参考值之间的符合度。通过测定真实性和精密度来确定。1.2 误差指测试样品符合规定的概率，尽管获得的是不符合规定的测定(是一个假的不符合规定的决定)。1.3 分析物将要检测、鉴别和/或定量的物质以及分析过程中产生的衍生物。1.4 误差测试样品确实不符合规定的概率，尽管获得的是符合规定的测定(是一个假的符合规定的决定)。1.5 偏差指检测结果与可接受参考值之间的差异。1.6 标准校准用参考基准值的测量值来代表所测物质量的测量手段。1.7 认证过的基准物质(CRM)CRM指一种有特定分析物含量赋值的物质材料。1.8 共色谱法指一个将提取物在进行色谱分离之
3、前分成两个部分的过程。第一部分进行色谱分离。第二部分与要测定的标准分析物混合。然后将该混合物也进行色谱分离。所加标准分析物的量必须与提取物中分析物的估计值相差不大。设计此方法是要提高采用色谱法时分析物的鉴别，特别是在没有适宜的内标物可用时。1.9 协同试验用相同的方法对相同的样品进行分析以确定该方法的性能特性。该试验包括随机测定误差和实验室偏差。1.10 确认方法能提供全面或补充信息使物质得到明确地鉴定，并且能在感兴趣的水平进行定量的方法。1.11 决定限度(CC)CC指等于和高于此值时，可以用误差概率得出认为样品不符合规定的结论的限度。1.12 检测容量(CC)CC指可以用误差概率检测、鉴别
4、和或定量样品中物质的最小含量。对于未确定允许限量的物质，检测容量是指用1统计学概率方法能够检测出真正污染的样品的最低浓度。对于已经建立允许限量的物质，检测容量则是指用1统计学概率方法能够检测出允许限量浓度的浓度。1.13 添加样品材料被已知量的待测物强化的样品。1.14实验室间试验(比对)由两个或多个实验室依照预先确定的测定检测性能条件，对同样品的检测进行组织、性能和评价测试。根据目的，试验可以分为协作试验和熟练程度试验。1.15 内标(IS)一种理化特性与待测分析物尽可能相同，并且样品中不存在的物质。它被加到每份样品中及每一个校准标准中。1.16 实验室样品被送到实验室作检查和测试而准备的一
5、种样品。1.17 关心水平样品中明显地确定其符合法规规定的物质或分析物的浓度。1.18 最低要求性能限度(MRPL)样品中至少必须检测和确认的分析物的最低含量。1.19 性能特点可以归结于分析方法的使用特点。这可以是特异性、准确性、真实性、精密度、重复性、重现性、回收率、检测性能和抗耐性。1.20 分析方法的性能标准可以来判断该方法是否适合于其目的、并产生可靠结果的性能特点要求。1.21 允许限度法规中确定的物质的最高残留限量、最高水平和其他最大耐受量。1.22 精密度在规定(预先确定)条件下，获得的相互独立的检测结果之间的一致程度。精密度测定通常用不精确性表示并以检测结果的标准偏差来计算。标
6、准偏差大则精密度就低。1.23 熟练试验允许实验室选择其自己的方法来分析同一个样品，假设这些方法在常规条件下使用。试验必须按照相应的标准操作程序来设计或执行，并可用来评价方法的重现性。1.24 定性方法一种可以根据物质的化学、生物学或物理特性鉴别该物质的分析方法。1.25 定量方法一种可以确定物质的数量或质量特性，以便可以用适当单位的数值表示的分析方法。1.26 试剂空白测定不用测试物或用相当数量的溶剂替代测试物而进行的全部分析过程。1.27 回收率在分析过程中回收到物质的实际浓度百分比。如果是没有认证过的基准物质，应在方法确认试验中予以测定。1.28 基准物质指其一种或几种特性已经被确认方法
7、所证实，从而可以用来校正设备或校验测定方法的物质。1.29 重复性在重复条件下的精密度。1.30 重复条件在同一个试验室由同一个操作人，用相同的仪器、相同的方法对同一个检测项目进行检测，获得的独立检测结果的条件。1.31 重现性在重现条件下的精密度。1.32 重现条件在不同试验室由不同的操作人，用不同的仪器、相同的方法对同一个检测项目进行检测，获得的独立检测结果的条件。1.33 抗耐性分析方法对试验条件，可以表示为样品材料、分析物、贮存条件、环境和或样品制备条件等改变的敏感性，在此条件下，该方法可以按现有方法应用或作特别的轻微修正。对于实际中可能遇到的各种变化(如试剂的稳定性、样品的组分、酸度
8、、温度)的所有试验条件，任何能够影响分析结果的变化都应尽可能的指出。1.34 样品空白测定对不含分析物的样品的测试部分进行的完整分析过程。1.35 筛选方法用来测定关注水平的某一物质或某类物质的存在方法。这些方法具有对样品的高吞吐量能力，并被用来对大量的样品进行审定，以确定是否潜在地不符合规定。它们应该特别地设计，以避免出现符合的假结果。1.36 单一实验室试验(室内确认)一种由一个实验室在适当长的时间间隔内，在不同的条件下，用一种方法来分析相同或不同的测试材料的分析试验。1.37 特异性一种区别被测分析物与其他物质的能力的方法。这种特性是所述测定技术的主要功能，但是可以根据化合物或基质的类别
9、而变化。1.38 标准添加指测试样品被分为两个(或多个)测试部分的过程。其中一部分直接分析，另一部分在分析前被添加了已知数量的标准分析物。所加标准分析物的量必须是样品中估计的分析物的量的2 倍到5 倍之间。考虑到分析过程的回收率，设计此步骤是要确定样品中的分析物的含量。1.39 标准分析物一种已知的，并被认证过含量和纯度，用作分析中参照物的分析物。1.40 物质 特定的或有确定化学组成的物质及其代谢物。1.41 测试部分指从进行检测或观察的测试样品分出的物质的量。1.42 测试样品指由一种实验室样品制备，并由此获取测试部分的一种样品。1.43 真实度从大量的测试结果获得的平均值与可接受的参照值
10、之间的符合程度。真实度通常以偏差表示。1.44 单位指ISO 31(20)和欧盟指令71/354/EC 中所述的那些单位。1.45 确认通过检查和提供有效的证据，以确定一个特定计划应用的具体要求得到实行。1.46 实验室内重复性在同一个试验室，在适当长的时间间隔内和在规定(预先确定)的条件下(涉及到如方法、测试材料、操作人员、环境)获得的精密度。2. 分析方法性能标准和其他要求2.1 总体要求2.1.1 样品处理样品应该以有最大机会检测出物质的方式获得、处理和加工。样品处理过程应防止偶然污染或丢失分析物的可能性。2.1.2 方法性能2.1.2.1 回收率在样品分析过程中，如果采用了一个固定的回
11、收率校正因子，则应对每一批样品测定回收率。如果回收率在限度以内，才能采用固定的回收率校正因子。否则，应采用从该批样品获得的特定回收率因子，除非采用标准添加程序(见3.5)或用内标法来定量测定样品中分析物，才可应用样品中分析物的特定回收率因子。2.1.2.2 特异性在试验条件下一个方法应能区分分析物和其他物质之间的差别。必须提供这种区别估计可能达到的程度。当采用所述的测定技术时需要克服任何可预见的来自物质(如同族物、同类物、要检测的残留物)代谢产物的干扰。特别重要的是要调查来自基质组分的干扰。2.2 筛选方法只有那些以记录的可追溯方式证明其有效，并且在测定的水平假符合串5(误差)的分析技术才可用
12、于指令96/23/EC 规定的筛选目的。在出现可疑结果时，应用确认方法进行确认。2.3 有机残留物和污染物的确认方法有机残留物或污染物的确认方法应提供关于分析物化学结构的信息。因此仅根据色谱分析而不采用光谱检测的方法不适于单独作为确认方法。但是，如果一个技术缺乏足够的特异性，应该通过包括合适的净化，色谱分离和光谱检测等分析技术来达到所需的特异性。以下方法或方法联合被认为是适于鉴定所指定的物质组的有机残留物或污染物。表1 有机残留物或污染物的确认方法（液相色谱部分）测定技术96/23/EC附录I物质限度带有质谱检测的液谱A 和B 组只要符合或在线或离线色谱分离只要采用全扫描技术或采用至少3（B组
13、）或4（A 组）个鉴别点作为不记录全部质谱的技术带红外光谱检测的液谱A 和B 组必须满足红外光谱吸收的特殊要求带二级管矩阵检测全程扫描的液谱B 组必须满足紫外光谱吸收的特殊要求带荧光检测的液谱B 组只适用于自然发射荧光的分子和经过转化或衍生后发射荧光的分子带紫外/可见光检测（单一波长）的液谱B 组只要采用至少两个不同的色谱系统或第二个独立的检测方法2.3.1 共同的性能标准和要求确认方法应提供关于分析物化学结构的信息。当有一个以上化合物给出相同反应时，那么该方法不应区别不开这些化合物。仅根据色谱分析而不采用光谱检测的方法不适于单独作为确认方法。如果在方法中使用内标物，内标物应在提取过程开始时就
14、加入到测试部分。根据可能性，内标物应采用稳定性同位素标记的分析物特别适用于质谱检测，或结构与分析物类似的化合物。当没有适宜的内标物可用时，分析物的鉴别应采用混合色谱来确认。此时，只需获得一个峰，增高的峰的高度(或面积)应等于加入的分析物的量。对于LC，半峰高处的峰宽应在原始峰宽的90110范围内，保留时间应在5范围内变化。参照物或含有等于或接近允许限度或判定限度(超标控制对照样品)的已知量的分析物添加材料，以及阴性控制材料和试剂空白最好应当在整个过程中与每一批分析的样品一块进行操作。注入提取物到分析仪器的顺序如下：试剂空白，阴性控制材料，需要确认的样品，阴性控制材料，最后是超标控制对照样品。任
15、何与这种顺序不同的变化应被证明是适宜的。2.3.2 对定量分析方法的额外性能标准和其他要求2.3.2.1 定量方法的真实度在重复分析己鉴定的参照材料时，试验测定的回收率折算己知值的平均质量范围的指导范围如表2。表2 定量方法的最低真实度真值含量（mg/kg）偏差范围（%）0.001-50 +200.0010.01-30 +100.01010-20 +101010001510001000010100005在没有认证过的基准物质可使用时，通过向空白基质中加入已知量的分析物得到的回收率来评价测定的真实度是可以接受的。用平均回收率折算的数据只有落在表2 所示的范围内才可接受。2.3.2.2 定量方法的
16、精密度对于测试物中的禁用物质，精密度实验应在方法测定低限、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限三个水平进行；对于已制定MRL的，精密度实验应在方法测定低限、MRL、选一合适点三个水平进行；对于未制定MRL的，精密度实验应在方法测定低限、常见限量指标、选一合适点三个水平进行。重复测定次数至少为6。实验室内部的变异系数参考范围见表3。表3 实验室内变异系数被测组分含量实验室内变异系数（CV，%）0.1 g/kg431 g/kg3010 g/kg21100 g/kg151 mg/kg1110 mg/kg7.5100 mg/kg5.31000 mg/kg3.81 %2.710 %2.0100 %1.3注
17、：对于低于100g/kg的质量范围，用Horwitz 公式计算会得出不可接受的高值。因此，欧盟对低于100g/kg 的质量范围时仅其CVs应尽可能地低。液相色谱工作岗位依据GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测执行此要求。对于在重复性条件下进行的分析，实验室内CV应特别地位于上述数值的1/22/3之间。对于在实验室内重现性条件下进行的分析，实验室内的CV不应大于重现性CV。对于有规定的允许限度的物质，方法应达到实验室内的重现性不大于在0.5 倍允许限度的浓度时相应得到的重现性CV。2.3.3 质谱检测性能标准和其他要求质谱分析作为确证方法适合的原则是仅用于在线或离线色
18、谱分离之后。2.3.3.1 色谱分离对LC-MS 操作，色谱分离应该选用合适的液相色谱柱。在任何情况下，检测条件下分析物最小可接受的保留时间是色谱柱死体积相应保留时间的二倍。测试部分分析物的保留时间(相对保留时间)应在特定保留时间平台内与校正的标准保留时间一致。保留时间平台应与色谱仪分辨率相当。分析物色谱保留时间和内标物保留时间的比率，即分析物的相对保留时间应与校准溶液的保留时间LC在土2.5%的允许误差一致。2.3.3.2 质谱检测质谱检测应当使用质谱技术，如全质谱记录(全扫描)或选择离子监控(SIM)，MS-MSn技术如选择多反应监控(MRM)或其他合适的MS、MS-MSn 技术与合适的离
19、子化模式联合使用。在高分辨率质谱(HRMS)中，全质谱范围10%峰谷上分辨率应典型地超过10000。全扫描：当质谱检测是通过执行全扫描光谱记录时，所有出现的测量诊断离子(分子离子、分子离子的特征加和物、特征碎片离子和同位素离子)的相对丰度超过校准标准品参照光谱丰度的10是必须的。选择离子监控(SIM)：当质谱检测是通过执行碎片谱时，分子离子可能是更适宜的测量诊断离子之一(分子离子、分子离子的特征加和离子、特征碎片离子、同位素离子)。选择的诊断离子不应该是起源于分子的相同部分。每一诊断离子的信噪比(S/N)应大于3。全扫描和选择离子监控：检测离子的相对丰度，用最强的离子或透过率的百分数表示。应该
20、与校准物质、校准物质溶液或吸取的样品溶液在可比较的浓度下和相同的条件下测定。离子强度应符合以下限度：表4 质谱技术中相对离于强度的最大允许限度范围相对强度(基线峰的)液相色谱多级质谱LC-MS，LC-MSn50202050251020301050质谱数据的解释：诊断离子和/或母离子/产物离子对必须通过比较光谱或单一质量跟踪信号的积分来鉴定。任何使用背景校正时，应在整批的测定规程中(见2.3.1，第四段)采用背景校正，并被清楚的指出。全扫描：在单一质谱图中全扫描光谱被记录时，至少存在4 个相对强度10基线峰的离子，如果分子离子在参照光谱中相对强度10，则分子离子峰必须包括在内。至少4个离子位于相
21、对离子强度的最大允许范围内(见表5)。计算机帮助的图库查询可以使用（如果有的情况下）。在这种情况下，测试样品的质谱数据和校准溶液的质谱数据的比较必须超过关键匹配因子。该因子将在对每一分析物光谱的确证过程和基本标准描述完成时被测定。光谱中由样品基质和检测器性能引起的变异性应该得到检查。选择离子监控(SIM)：当质谱碎片被非全扫描技术所测量时，一系列的识别点将用于解释数据。96/23/EC 指令附录的A 组的物质的确认需要最少4 个识别点，96/23/EC 指令附录的B 组的物质的确认需要最少3个识别点。表5为每一种最基本的质谱技术能够获得的识别点数量。然而，为了使需要确认的识别点具有资格，识别点
22、的总和可以按以下计算：(a)最小至少一个离子对被测定：(b)所有相对测定的离子对满足上述描述的标准；(c)最多三个独立技术能联合使用达到最小识别点数。表 5 质谱碎片分类范围和所获得的识别点之间的关系质谱技术获得每一离子的鉴别点数低分辨率质谱(LR)1.0低分辨率质谱多级质谱母离子1.0低分辨率质谱多级质谱转换产物1.5高分辨率质谱(HRMS)2.0高分辨多级质谱母离子2.0高分辨多级质谱转换产物2.5注解：(1)每一种离子只能计算一次： (2)使用不同的化学物质产生的衍生物可以用于增加不同分析物的识别点数；(3)对96/23/EC 指令下附录I的A组的物质，如果在分析过程中以下技术之一被使用
23、，且该技术的相对标准己完成，则可以贡献最多一个识别点。HPLC 与全扫面二极管点阵(DAD)连用：HPLC 与荧光检测器连用；HPLC 与免疫血清学连用； (4)转换产物包括子离子和次级子离子产物。表6 质谱技术和连用技术获得识别点数的例子(n一个整数)技术离子数鉴别点数LC-MSNNLC-MS-MS1个母离子十2 个子离子4LC-MS-MS2个母离子，每个有1个子离子5LC-MS-MS-MS1 个母离子，1 个子离子，2 个次级子离子5.5HRMSN2N2.3.4 使用其他检测技术的液相测定分析物的性能标准和其他要求。2.3.4.1 色谱分离如果可以获得用于这一目的的一种物质，内标物质应该尽
24、可能的使用。如果相关物的保留时间与分析物的保留时间接近，则是更合适的。相同实验条件下，分析物在相应校准标准品典型的保留时间下被洗脱。分析物最小可接受的保留时间是2倍的色谱柱死体积相应的保留时间。分析物和内标物保留时间的比值，即分析物的相对保留时间，应该与校准标准品的比值在合适的范围内相同，允许2.5误差。2.3.4.2 全扫描UVVIS 检测液相方法的性能标准必须达到。分析物光谱最大吸收波长应该与在检测系统分辨率测定误差范围内的校准标准品的最大吸收波长相同。对二极管点阵检测器，允许误差值为2nm。对于220nm 以上的分析物，具有相对吸收系数10的两个光谱部分，其光谱应该与校准标准品光谱没有显
25、而易见的区别。首先存在相同的最大吸收，其次两个光谱中在与校准标准品吸收系数10部分没有观察到区别，即为符合标准。如果使用计算机帮助的图库搜寻和匹配，测试样品的光谱数据与校准标准品光谱数据比较必须超过标准匹配因子。该因子在分析物己完成以上描述标准为基础的光谱确证过程期间被测定。样品基质和检测器性能引起的变异应该被检查。2.3.4.3 荧光检测的性能标准液相方法的性能标准必须达到。该方法将应用于显示自身荧光的分子和在转化或衍生后显示荧光的分子。结合色谱条件的激发和吸收波长的选择应该以在空白样品中发生干扰组分减少到最小的方式完成。色谱条件下最近的峰的极大处应该与指定分析物的峰分离，至少为完整的分析物
26、峰的最大高度10的一个全峰峰宽。2.3.4.4 使用带UV/VIS 检测(单波长)的LC测定分析物带UV/VIS 检测(单波长)的LC 方法本身作为确证方法使用是不适当的。色谱条件下最近的峰的极大处应该与指定的分析物的峰分离，至少为完整的分析物的峰的最大高度10的一个全峰宽度。3确证确证将证明分析方法应遵照标准中可适用的相关的性能特征。不同的检查目的要求不同的方法种类。下表确定了方法类型检验的性能特征。表7 分析方法通过已确定了的性能特征的分类方法检测容量CC决定限度CC真实度/回收率精密度选择性/特异性实用性/耐用性/稳定性定性S+-+方法C+-+定量S+-+方法C+注：S筛选法；C确认方法
27、；十必需测定的31 确证程序本章为分析方法的确证程序提供了例证和或参考资料。其他证明分析方法符合需要使用性能标准的性能标准的方法，只要他们达到同样的水平和同质的信息。确证也能通过进行如食品法典，国际标准化组织(ISO)或国际理论和应用化学联合会(IUPAC)确定的实验室内试验来完成，或根据替代方法如单个实验室试验或内部确证。本部分集中关注使用模型方法的单个实验室试验(内部确证)。这个方法由以下部分组成：(a)一套独立于所用确证模型的共同性能特征； (b)在表8 中所描述的更具体的模型决定程序。表 8 独立模式和相关模式的性能参数（确证）独立模式性能参数相关模式性能参数共同性能参数（3.1.1）
28、传统确证方法（3.1.2）内部确证方法（3.1.3）特异性回收率回收率真实性重复性重复性耐用性：微小变化室内重现性室内重现性稳定性重现性重现性定量限(CC)定量限(CC)检测限(CC)检测限(CC)标准曲线标准曲线耐用性：主要变化耐用性3.1.1 独立模型性能标准无论选择那种确证方法，下面的性能特性必须确定。为减少工作负荷量，可以采用仔细设计并具有统计意义的方法将测定不同参数的试验合并进行。3.1.1.1 特异性对于分析方法，分析物和接近的相关物质(同分异构体、代谢物、降解物、内源性物质、基质组成成分等)之间的鉴别能力是重要的。必须有两种方法检查干扰情况。因此，应选出潜在的干扰物质，并且有关的
29、空白样品应经分析，以检测可能存在的干扰和估计干扰的影响：选择一系列化学相关的化合物(代谢物、衍生物等)或其他可能在样品中存在影响的、可能遇到的物质；分析适当数量的有代表性的空白样品(n20)，检查在期望目标分析物被洗脱的影响区域内的任何干扰(信号、峰、离子踪迹)；此外，有代表性的空白样品应添加相关浓度的可能干扰分析物的鉴别和/或定量的有关物质；分析以后，检查是否：(a)存在的干扰可能导致错误的鉴定；(b)目标分析物的鉴定被一个或多个干扰所阻碍：或(c)定量分析显著地受到影响。3.1.1.2 真实性在本节，定量的真实性(准确度的一个组分)被描述。真实性只能通过用认证的基准物质(CRM)来确认。基
30、准物质只要可得到就应使用。该程序在ISO 57254(5)中被详细描述。举例如下：按照方法测试指南分析六份基准物质的重复样品；测定存在于每份重复样品中分析物的浓度；计算这些浓度值的平均值、标准偏差和变异系数()；通过将测定的浓度平均值除以核准值(测定浓度)再乘以100 计算真实性，结果用百分数表示。真实性()检测的平均回收校正浓度100核准值如果得不到基准物质，用4.1.2.1 项下的描述测定回收率代替准确性。3.1.1.3 实用性/耐用性(较小的变化)这样的研究通过实验室故意引入较小的合理的变化和观察它们的后果进行。预调查研究必须通过选择可能影响测定结果的样品的预处理、净化和分析因素进行。这
31、样的因素可能包括分析员、试剂的来源和年限、溶剂、标准品和样品提取物、加热速度、温度、pH 值和许多其他可能在实验室出现的因素。这些因素应用在不同实验室之间通常遇到的偏差比较得出的数量级进行校正；鉴别能影响结果的可能因素；轻微地改变每一因素；用Youden的方法实施耐用性试验。(在这点上其他的方法也可使用。但是Youden方法使要求的时间和努力最小。Youd方法是一种部分因素的设计。不同因素间的相互作用不能被检测出；一旦发现有因素对测定结果产生重大影响，要实施进一步的实验以确定这一因素可接受的限度；对结果有重大影响的因素应在方法草案中清楚地表示出来。基本的概念不是一次研究一个改变而是一次引入两三
32、个变化。例如，让A、B、C、D、E、F、G 表示七个不同的能影响结果因素的名义上的值，如果它们名义上的值轻微变化，用相应的小写字母a、b、c、d、e、f 和g 表示它们的替换值。这样结果有27或128 种不同的可能的组合。在这些组合中，可以选择一个有八种组合的大小写字母平衡分配的子集(表9)。必须进行八次测定，每次采用选择的因素的一种组合(AG)。测定的结果在表9 中显示为SZ。表9 耐用性研究试验设计(较小的变化)因素值测定数字的组合F12345678A/aAAAAaaaaB/bBBBbBBbbC/cCCCcCcCcD/dDDddddDDE/eEeEeeEeEF/fFffFFffFG/gGg
33、gGgGGg观察的结果RSTUVWXYZ3.1.1.4 稳定性已经观察到样品中分析物或基质组成成分在保存或分析过程中不十分稳定可能引起分析结果中出现严重偏差。此外，应检查校准标准品在溶液中的稳定性。通常分析物在不同的贮存条件下的稳定性被很好地描述。保存条件的监测将构成常规实验室认可系统的一部分。当这些不知道时，下面举例说明如何测定稳定性。溶液中分析物的稳定性：制备新鲜分析物储备液，并按试验指南稀释以获得足够份数(例如40)的指定浓度的溶液(未建立允许限量的物质，为最小要求性能限度，其他物质围绕允许的限度)。准备两种分析物溶液，一种作为添加的溶液，一种作为最终的分析溶液，以及其他感兴趣的溶液(例
34、如衍生的标准品)。依据试验指南测定分析物在新鲜制备的溶液中的含量。分装适宜的体积至合适的容器中，贴标签并根据计划保存：表10 分析物在溶液中稳定性测定计划保存条件20十 4十 20暗处10 等份试样10 等份试样10 等份试样亮处10 等份试样保存时间可以选择为1、2、3、4 星期或根据需要选择更长时间，必要时直到在鉴别和或定量试验中观察到第一次降解现象。要记录最长保存时间和最佳保存条件。每一等份分试样中分析物浓度的计算应以新鲜制备的分析物溶液的浓度为100进行。剩余的分析物()Cil00C新鲜式中：Ci某一时间点的浓度；C新鲜新鲜溶液的浓度。基质中分析物的稳定性：只要可能，应选用实际的样品。
35、得不到实际的样品时，应用添加分析物的基质。当可以得到实际的材料时，材料的浓度应在新鲜配制时测定。材料进一步等份分样品可以在1、2、4 和20 周后取并测定浓度。组织应至少储存在20以下或根据要求采用更低的温度。如果得不到实际的材料，取一些空白材料并混合均匀。将材料分为5 等份样品，每份样品中添加分析物，分析物最好制备于少量水溶液中，立即分析一份样品。储存剩余的样品于至少在20以下或根据要求采用更低的温度，并于1、2、4 和20 周后分析。3.1.1.5 校准曲线当校准曲线用于定量时：至少有五个水平(包括零)用于绘制曲线；要描述曲线的工作范围；要描述曲线的数学公式和数据对曲线的吻合情况；要描述曲
36、线可接受的参数范围。当必须进行基于一个标准溶液的一系列校准时，要指出校准曲线参数可接受的范围，该范围可以在不同的系列变化。对于筛选方法，线性回归方程的相关系数不应低于0.98，对于确证方法，相关系数不应低于0.99。测试溶液中被测组分浓度必须在校准曲线的线性范围内。3.1.2 传统的确证程序依据传统的方法计算参数要求有几个单独的试验工作。每一工作特性由每一主要变化决定(见上述的实用性/耐用性项下)。对于多组分分析方法，只要先前可能的有关干扰能被排除，几个分析物可以被同时分析。几个工作特性可以被一个相似的方法确定。所以，为减少工作量，建议可能的情况下组合试验(例如，重现性和实验室内的特异性检测的
37、重现性，确定决定限的空白样品分析和特异性检测的试验)。3.1.2.1 回收率如果没有认证过的基准物质，回收率必须通过空白添加试验确定，举例如下：选择18 等份空白样品，分别以1、1.5、2 倍最小要求性能限量或0.5、1、1.5 倍允许限量添加到6 等份样品；分析样品并且计算每份样品的浓度；用下列方程式，计算每份样品的回收率；计算平均回收率和每一添加水平6 个结果的CV；回收率()100测定含量添加浓度水平。这个测定回收率的常规方法是在3.5 中描述的标准附加方法的变种，用于：样品被认为是用空白样品而非要分析的样品；试验样品有相同的质量和试验部分提取物有相同的体积；加入到第二(添加)试验部分的
38、校准标准品的数量记为XADD(XADDAVA)；X1 是空白的测定值、X2 是第二(添加)试验部分测定值；然后,回收率()100(X2X1)XADD。当没有得到任何上述条件(或假定)，那就意味着测定回收率的程序不得不完全执行3.5中描述的标准附加方法。3.1.2.2 重复性制备一系列同一基质的样品，添加分析物使浓度为1、1.5、2 倍最小要求性能限量或0.5、1、1.5 倍允许限量；每一水平的分析应至少重复6 次；分析样品；计算每份样品的测定浓度，求出平均值、标准偏差和添加样品的变异系数()；至少在两个其他条件下重复这些步骤：计算所有的平均浓度和添加样品的CVs。3.1.2.3.实验室内的重现
39、性制备一系列指定试验物质(同一的或不同的基质)的样品，添加分析物使浓度为1、1.5、2 倍最小要求性能限量或0.5、1、1.5 倍允许限量：每一水平的分析应至少重复6 次；由不同的操作者在不同的环境中至少两次重复这些步骤，如不同批次的试剂、溶剂等，不同的室温，不同的仪器等，如果可能的话；分析样品：计算每份样品的测定浓度：求出平均值、标准偏差和添加样品的变异系数()。3.1.2.4 重现性当重现性需要验证时，实验室应当依据ISO 57252(5)参与合作研究。3.1.2.5 确定限(CC)确定限要依据“分析方法的工作标准和其他要求”(第2 部分)中关于鉴别或鉴别加定量定义的要求确定。如果该物质的
40、允许限度还没有建立，则按照下列方法确定CC：要么按照ISO11843(17)采用校准曲线方法(这里指的是净状态变量的临界值)。在这种情况下，应使用空白物质，按照等距离梯度添加物质，使之等于和高于反应所需的最低量。分析样品。鉴定后，根据添加的物质浓度绘图。Y 轴上的相应浓度加实验室内部重现性的标准差的2.33 倍，即等于决定限度。这种方法仅适用于定量检测(1)：或通过分析每种矩阵至少20个空白物质，以便能够计算预期存在分析物的时间窗口中信号与噪音比。可以将信号嗓音比的3 倍作为决定限度。这种方法适用于定性和定量检测。如果该物质的允许限度已经建立，则按照下列方法确定CC：要么按照ISO11843(
41、17)采用校准曲线方法(这里指的是净状态变量的临界值)。在这种情况下，应使用空白物质，按照等距离梯度添加物质，使之位于允许限度周围。分析样品。鉴定后，根据添加的物质浓度绘图。处于允许限度时的相应浓度加实验室内部重现性的标准差的1.64 倍，即等于决定限度(5)；或通过分析每种矩阵至少20 个添加了允许限度的分析物的空白物质。处于允许限度时的浓度加相应标准差的1.64 倍，即等于决定限度(5)。也可见第5 款和3.2。3.1.2.6 检测容量(CC)应根据所定义的(见第2 部分)筛选、鉴别或鉴别加定量的要求确定检测容量。如果该物质的允许限度还没有建立，则按照下列方法确定cc：按照ISO11843
42、(17)采用校准曲线方法(这里指的是净状态变量的最低可检测值)。在这种情况下，应使用有代表性的空白物质，按照等距离梯度添加物质，使等于和低于反应所需的最低量。分析样品。鉴定后，根据添加的物质浓度绘图。决定限度时的相应浓度加决定限度时的平均检测含量的实验室内部重现性标准差的1.64 倍，即等于检测容量(5)；分析每种矩阵至少20 个添加有决定限度水平的分析物的空白物质。分析样品，对分析物进行鉴别。决定限度值加检测含量的实验室内部重现性标准差的1.64 倍，即等于检测容量(5)；在不能获得定量结果时，可以通过对添加量大于或等于决定限度的空白物质进行研究来确定检测容量。在这种情况下，仅仅保留5错误的
43、顺应的结果，浓度水平等于该方法的检测容量。因此，为了保证该检测具有可靠的基础，应至少对一个浓度水平进行至少20 个次检测。如果该物质的允许限度已经建立，则按照下列方法确定CC：要么按照ISO 11843(17)采用校准曲线方法(这里指的是净状态变量的最低可检测值)。在这种情况下，应使用有代表性的空白物质，按照等距离梯度添加物质，使之位于允许限度周围。分析样品并鉴定分析物。计算决定限度时的平均检测含量的标准差。决定限度时的相应浓度加实验室内部重现性标准差的1.64 倍，即等于检测容量(5)；或通过分析每种矩阵至少20 个添加了决定限度的分析物的空白物质。处于决定限度时的值加相应标准差的1.64
44、倍，即等于决定限度(5)。也可见3.2。3.1.2.7 耐用程度(大的变化)应在不同实验条件下对分析方法进行检验，例如包括：不同种类、不同矩阵或不同抽样环境。引入的变化应该是大的变化。能够采用诸如Youden 方法(15)(16)对这些变化的重要性进行评估。对于已经证明对测定结果具有重大影响的所有大的变化，应对其每个操作特性进行确定。3.1.3 根据替代模型所做的验证在应用替代的验证方法时，验证草案中应提出基本的模型和策略及其有关先决条件、假设和公式，或者至少应对其适用性给出参考文献。例如，在应用室内验证模型时，确定操作特性的方式应该允许在相同的验证程序中能够进行大的变化的验证。3.1.3.1 实验计划应根据所研究的不同种类和不同因子的数量对实验计划进行设计。因此，整个验证程序的第1步是，分析在将来的实验室中为了筛选最重要的种类而将用于分析的样品种群以及可能影响测定结果的那些因素。随后，应根据关心水平选择浓度范围。每个浓度水平的可重复性(Sir)；每个浓度水平的实验室内部重现性(Sir)；决定限度(CC)；检测容量(CC)：浓度曲线(误差率对浓度，见3.1.3.2)；大的变化的粗糙度：对小的变化的粗糙度可以根据3.1.1.3 进行确定：样品相关的校准曲线；1 个总的校
