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1、实验一 植物核酸提取一、植物叶片总DNA的大量提取【实验原理】CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶
2、解在液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 【实验目的】利用CTAB法从植物叶片组织中提取高质量DNA。【主要试剂】1. CTAB提取缓冲液：1.4M NaCl，100mM Tris pH 8.0，2% CTAB，20mM EDTA，0.5% NaHSO3，2% -巯基乙醇。室温保存，五年有效。2. 氯仿：室温保存，五年有效。3. 无水乙醇：-20保存，五年有效。4. 70%乙醇溶液：将无水乙醇和H2O按7:3混合。室温保存，五年有效
3、。5. TE 缓冲液（250ml）：2.5ml 1 M Tris-HCl，pH8.0（10mM）；0.5ml 0.5M EDTA，pH8.0（1mM）；加H2O至250ml。室温保存，五年有效。【操作步骤】1. 在液氮中将叶片研磨粉碎，取1-4克样品于合适的离心管中（初始样品为1克，用13ml管；初始样品1克，用50ml管）。2. 每1克样品加入5ml CTAB提取缓冲液和25-50ug RNase A（可选），颠倒混匀，60-70水浴孵育40-50min，期间混匀2-3次。3. 从水浴中取出样品，冷却至室温。可选：20-25，3000g离心3min，转移上清液到新管中。4. 每1克样品加入5
4、ml氯仿。颠倒混匀2-3min。5. 20-25，10300g离心8-10min，转移上清液到新管中。6. 加入等体积氯仿，重复步骤4和5。可选：步骤4和5可重复多次，直到获得澄清的上清液。7. 加入等体积的无水乙醇，轻缓颠倒混匀，直到沉淀出现。8. 沉淀DNA。方法1：钩出DNA。（1） 用接种环钩出DNA（可选：1000g离心1min，富集DNA）。（2） 将DNA（可将多个样品的DNA合并成一管）加入70%乙醇溶液中。初始样品为1ml，加入装有1-1.5ml 70%乙醇的1.5ml离心管；初始样品1ml，加入装有10-12ml 70%乙醇的50ml离心管。（3） 20-25，13000r
5、pm（1.5ml管）或5100g（50ml管）离心5-7min，弃上清。可选：用上述相同体积的70%乙醇重复洗涤DNA沉淀1次。可选：接步骤（3），以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。方法2：离心沉淀DNA。（1）20-25，5100g离心5-7min，弃上清。（2）加入5-6ml（13ml管）或10-12ml（50ml管）70%乙醇溶液洗涤DNA沉淀，20-25，5100g离心5-7min，弃上清。可选：重复步骤（2）1次。可选：接步骤（2），以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。9. 干燥DNA。真空干燥10min，空气干燥1h（30min左右），DNA过度干燥会导致难以溶解
6、。10. 每1ml样品加入100-250ul TE缓冲液溶解DNA。也可适当增加TE缓冲液用量，或将DNA溶液置于70孵育1-4h，促进DNA溶解。相同样品可合并。可4过夜溶解。11. DNA溶解完全后，将溶液转入1.5ml离心管。测定DNA浓度后，根据需要，将DNA溶液分装（每管分装1个酶切体系所需DNA量，10ug/管），保存于4、-20或-80冰箱。DNA样品应有唯一性编号，并与原始样品相对应。12. 跑0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，ND1000分光光度计测量DNA浓度。OD230/OD260 0.4 0.5说明有盐残留OD260/OD280 =1.71.9说明纯度很好OD
7、260/OD280 2.0说明有有RNA污染【注意事项】1. 研磨前，研钵、离心管、药勺等物品均需用液氮预冷彻底，研磨过程应保证样品不融化，研磨应足够细。2. 提取过程中，应采用颠倒混匀方式，而不能涡旋混匀，所有过程保证离心管盖盖好，防止液体漏出。3. CTAB缓冲液裂解温度一般为65，孵育结束后，应彻底冷却至室温，该步骤可持续1-2h。4. 加入氯仿后，应彻底混匀2-3min。5. 钩出DNA时，动作要轻缓，洗涤后要除尽乙醇。6. TE缓冲液适用于基因组DNA、质粒DNA长期保存，ddH2O适用于短期保存。DNA溶解后，轻缓晃动离心管，若溶液中有气泡，表明DNA浓度过高，需再加入适量TE缓冲
8、液。7. 测定DNA溶液浓度前，应用吸头混匀溶液。8. ND1000分光光度计测量DNA浓度，重复两次。若样品DNA浓度为2-100ng/ul，两次重复差值2ng/ul；若样品DNA浓度100ng/ul，两次重复差值2%。【参考电泳图片】完整度好时电泳带型：单一无拖尾，点样孔无残留杂质如下图：提取效果不好如下图：RNA残留蛋白残留拖尾降解二、植物叶片总RNA的大量提取【实验原理】植物细胞内的RNA主要是 rRNA（占8085）、tRNA及小分子RNA（占1015）和 mRNA（占15）。rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数
9、mRNA在3端都有一个polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(Oligo-dT)层析柱从总RNA中将 mRNA分离出来。一般情况下，提取的总RNA也可用于Northern blot试验。已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，常用的有3种。（1）苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；（2）盐酸胍法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；（3）氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制
10、作用。采用Trizol 试剂盒提取总RNA，其原理是依据盐酸胍法。Trizol法适用于动物、植物和微生物组织，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA 污染。RNA可直接用于Northern分析，Poly（A）分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆等。异硫氢酸胍：有效地RNAse抑制剂。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离，又对RNA酶有强烈的变性作用。-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少RNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。酸酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解
11、作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与核酸联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而核酸溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。【实验目的】从植物叶片组织中提取高质量RNA。【主要试剂】1、4M GT溶液：4M GT异硫氢酸胍（Guanidine thiocyanate），25m M 柠檬酸钠（Sodium citrate）
12、，0.5%(w/v) 十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)，高压灭菌之后，加入巯基乙醇到0.1M（体积比大约为：1.0%）2、2M NaAC（ph值4.9-5.2）3、3M NaAC4、4M LiCL5、DEPC H2Ov/v 0.1% DEPC处理的ddH2O（37处理12h以上，处理过程要不断搅拌，高温高压灭菌去除残留） 或TE。【操作步骤】1. 植物组织1g，液氮研磨；2. 倒入50ml离心管中（管中事先放3ml的4M GT，冰浴），震荡混匀；3. 加入0.3ml 2M 的NaAC，震荡混匀；4. 加入3ml酸酚（水饱和酚抗氧化剂0.1%(w/v)-羟基喹啉-Hydroxyquinoli
13、ne），震荡混匀；5. 加入1ml氯仿，震荡混匀，6000rpm，13min，取上清；6. 加入2倍体积的乙醇，-20度过夜（几小时也可以，产量可能会低）；6000rpm，离心10min，弃上清，留沉淀；7. 加入1ml 4M的LiCL（放1.5ml离心管中）；13000rpm，10-15min，留沉淀；8. 加入0.4mlDEPC处理的水，溶解；9. 加入1/2体积的酸酚和1/2的氯仿，震荡混匀；10. 13000rpm，离心5min，取上清液；11. 加入1倍体积的氯仿；13000rpm，离心5min，取上清液；12. 加入0.1倍体积的3M NaAC和2倍体积乙醇；震荡混匀，-20度过夜
14、；13. 13000rpm，离心5min，留沉淀；14. 沉淀RNA晾干，DEPC水或TE溶解（4060ul）。注：RNA溶解时不要晾太干，会导致难以溶解。【RNA甲醛电泳】1、试剂配制5X甲醛凝胶电泳缓冲液：0.1mol/L MOPS （pH7.0）40mmol/L 乙酸钠5mmol/L EDTA （pH8.0）注：将20.6g MOPS溶于800ml经用DEPC处理的50mmol/L乙酸钠溶液（用DEPC处理）用氢氧化钠将溶液的ph值调至7.0，加入10ml经用DEPC处理的0.5mmol/LEDTA（pH8.0）再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。高压灭菌，室温保存于棕色瓶子中（
15、光照或高压灭菌后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用，而深黄色缓冲液则不然）。甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油1mmol/L EDTA（pH8.0）0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF2、电泳方法注： 所有用于配制与RNA接触的溶液的水需预先经DEPC处理。凝胶制备RNA甲醛变性凝胶浓度通常为11.5%。现配制1.2%凝胶28ml：（1）称取0.21g 琼脂糖，17.5ml DEPC水，微波炉熔化；（2）冷却至5060，加入37%甲醛5.0ml，5X甲醛电泳缓冲液5.5ml，EB 2ul（用于转膜可以不加），混匀；（3） 倒胶，室温放置30min以上，使胶彻底凝固；（4）RNA变性体系RNA
16、 4.5ul5X 甲醛凝胶电泳缓冲液 2.0ul甲醛 3.5ul甲酰胺 10.0ul混匀，6515分钟，迅速冰浴5分钟，稍离心。加入甲醛凝胶加样缓冲液2ul。（5）电泳过程A. 先将凝胶放入1X 甲醛凝胶电泳液中100V预电泳530分钟；B. 点样，100V电泳4560分钟；C. 照相。D.纯度（OD260/OD280）：紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.11.0之间，通常离心柱法稀释10倍左右； 溶液裂解法稀释4050倍）OD260/OD280 1.92.1说明有部分降解；浓度：用ND1000分光光度计测量，重复两次。【注意事项】1. 所有药品都应用DEPC
17、水来配制。所需要的离心管、枪头等都需要用1%的DEPC水处理过夜，然后高压灭菌。2. 做试验的非塑料器皿用具需要160-180烘干4-8小时。3. 做试验的桌面要用1N/L的HCl擦拭，后再用70%乙醇擦拭晾干。4. 提取过程尽量带手套和口罩。5. DEPC水的配置：须在通风厨里带手套操作。【参考电泳图片】Marker（天根 Marker III）：200，500，800，1200，2000，3000，4500，红色箭头是28s片段，白色箭头是18s片段。如果提取的RNA完整度好，28S亮度应该是18S的两倍以上，这两条带清晰，带的边缘可见。实验二 细菌实验一、大肠杆菌细胞的活化【实验步骤】1
18、. 配制LB培养基（液体和固体）高温灭菌（120灭菌20min）。配制实验中所使用的各种抗生素（0.22um抽滤灭菌），将玻璃培养皿或可灭菌的塑料培养皿高温灭菌（同上）。2. 倒LB培养基平板。将所用物品放入超净台中超净工作台灭菌（打开紫外灯，照射15 min，完毕后打开风机吹5min）。融化已灭好菌的LB固体培养基，室温凉至5060，根据质粒及菌种的特性加入相应的抗生素（如：Amp、Kan、Spe、Rif等），摇匀。倒入玻璃或可高温灭菌的塑料平板中。温度与速度都很重要，因为高温使抗生素失效，且培养基中琼脂含量较高，易凝固而无法使抗生素混匀，且不易全部倒出。3. 划线。使用接种环（或枪头）在冻
19、存管中粘取菌液，左手将倒好的LB平板在酒精灯火焰旁打开，接种环（或枪头）在平板表面至少作三次“之”字形划线。每次划线后要烧接种环（或更换枪头），再从上一次划痕的尾部拉出后划下一区。4. 将画好线的平板于37恒温培养箱中，倒置培养过夜（12hr以上）。【主要试剂】1、LB（250mL）液体培养基：固体培养基（添加琼脂）NaCl2.5gNaCl2.5g胰蛋白胨2.5g胰蛋白胨2.5g酵母提取物 1.25g 酵母提取物1.25g 琼脂4.0g120灭菌20min。2、 Amp50（50mg/ml）称取5g氨苄青霉素，溶于100ml水中。0.22um抽滤灭菌，分装于离心管中，-20保存。3、 Kan5
20、0（50mg/ml）称取5g卡纳霉素，溶于100ml水中。0.22um抽滤灭菌，分装于离心管中，-20保存。4、 Rif50（50mg/ml）称取5g利福平，溶于100ml水中。0.22um抽滤灭菌，分装于离心管中，-20保存。5、 Spe50（50mg/ml）称取5g壮观霉素，溶于100ml水中。0.22um抽滤灭菌，分装于离心管中，-20保存。二、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验步骤】1. 挑取一个单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37/200rpm 培养过夜。2. 取500ul过夜培养的菌液加入50mlLB培养基（按照1:100的比例），37/200rpm培养3-4hr,经分光光度计测
21、量，OD值在0.30.4之间。3. 将菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min（同时冰浴CaCl2溶液）。4. 4，4000rpm离心10min，回收细胞，弃上清（倒去液体）。将离心管倒置于滤纸上1min。每管用冰冷的0.1M CaCl2 溶液10mL悬浮沉淀，冰浴30min。5. 4，4000rpm 离心10min，回收细胞，弃上清。用冰冷的0.1M CaCl2（含甘油）溶液1mL悬浮细胞。分装细胞，每100L一份倒入1.5mL离心管中，此细胞即为感受态细胞，可直接转化或-70保存。【主要试剂】1、0.1M CaCl2称取1.2g CaCl2溶解于80ml蒸馏水中，加蒸馏水定容至100ml，
22、高温灭菌。2、0.1M CaCl2（含甘油）称取1.2g CaCl2溶解于80ml蒸馏水中，再添加15ml甘油，最后加蒸馏水定容至100ml，高温灭菌。三、质粒DNA转化大肠杆菌【实验步骤】1. 从-70冰箱中取出一管感受态细胞，加入120ul质粒（或连接产物），冰浴30min。质粒一般1ul足以，连接产物为510ul，最都不要超过20ul否则反而影响转化效果。2. 42热击90s（注：应在冰浴时先打开水浴锅，使温度升到42）。立即将离心管转移至冰浴2min，该过程尽量不要摇动离心管。3. 加500L LB液体培养基，37，180rpm 培养60min。4. 根据质粒抗性情况，吸取50200u
23、l菌液涂布于添加了对应抗生素的平板上。如果浓度不是很高时，可以先4000rpm离心收集菌体再涂到平板上。（注：涂菌器沾酒精反复烧三次，以消毒灭菌）5. 37倒置过夜。四、菌落PCR检测【实验步骤】1. 按如下表所示向离心管中添加药品：25uL的反应体系2x PCR mix12.5ul上游引物 1ul下游引物 1ulddH2O 10.5ul10x buffer 2.5uLdNTP 2uL上游引物 1ul下游引物 1ulTagE 0.25 uLddH2O 19.75ul2. 挑取半个单菌落，加入到25uL的反应体系中，做PCR检测，并做标记。3. 反应条件设置为：94预变性10min，94变性60
24、s，55退火30s，74延伸2min，共30循环，最后72延伸10min。4. 扩增产物于含荧光染料的1%琼脂糖凝胶电泳。五、电泳【实验步骤】1. 配制TBE电泳缓冲液0.5x TBE（10x TBE 缓冲液 50mL 加水至1L）；2. 称取0.2g琼脂糖于20mL 0.5x TBE中，加热混匀，配成1%琼脂糖凝胶；3. 粘胶带，插梳子；4. 凝胶冷却至60，加0.2uL荧光染料，摇匀后倒入电泳槽。20分钟左右可凝固。双手均衡用力取下梳子，动作要慢；5. 将0.5x TBE 倒入电泳槽中，约超过胶面1cm（开始可略少，以便于点样）；6. 取一块封口膜，将溴酚蓝点于其上，取5uL待点样品同溴酚
25、蓝混匀。7. 逐个点样，两边分别点Marker。8. 连接电源。正极（+）接远离点样孔一端，负极（-）接近点样孔一端；9. 待溴酚蓝跑至凝胶2/3处，关闭电源，紫外观察，照相保存。【主要试剂】110x TBE 电泳缓冲液0.45mol/L Tris碱，0.45mol/L 硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA（PH8.0），加水定容至100mL 26x 上样缓冲液0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，15%聚蔗糖水溶液，室温保存。六、质粒DNA提取（碱裂解法小量）【实验步骤】1. 挑取一个含重组质粒的单菌落接种于5mL 含对应抗生素的LB液体培养基的大试管中，37，180rpm震荡培养
26、过夜。也可将菌种按照1:100的比例进行接种。2. 将14mL菌液移入离心管中，4000rpm离心2min。吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。（离心2次，弃上清，倒置于滤纸上）3. 将细胞沉淀悬浮于100L溶液I（冰预冷）中，充分混匀，室温放置10min。（上下颠倒混匀，可稍用力轻弹，此时配溶液II，并冰浴溶液III）4. 加200L溶液II（新鲜配制），盖紧管口，混匀内容物，冰上放置至澄清，该过程不能超过5min。（溶液II需要新鲜配制，两种溶液使用前预混。该过程动作务必轻柔。）5. 加入150L冰冷的溶液III，盖紧管口，此时出现白色絮状，颠倒数次使混匀，冰上放置3min5min。6. 4
27、/12000rpm 离心5min，取上清移至另一离心管中。7. 向上清中加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，4/12000rpm 离心5min，吸取上清移至另一离心管中。8. 向上清中加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的3M NaAc（pH 5.2），混匀后，冰浴10分钟，4/12000rpm 离心5min，弃上清，倒置离心管于滤纸上。（上清和乙醇总体积的1/10为NaAc体积）9. 用1mL 70%乙醇洗涤质粒沉淀（在沉淀的另一侧加乙醇，不要将沉淀冲起来），振荡并离心，倒去上清液。10. 待酒精挥发干净后，加20L TE缓冲液，其中含有20g/mL的胰RNA酶，放在37水
28、浴中保温1h，使DNA完全溶解，-20保存。【主要试剂】1. 1M TrisCl缓冲液（1L）pH 8.0称取121.1g Tris溶于800mL水中，搅拌条件下加入浓盐酸（pH 7.4约使用浓HCl 70mL；pH 7.6约使用60mL，pH 8.0约使用42mL），溶液冷却至室温，用盐酸准确调pH值至8.0，加入重蒸水至总体积1L，分装，高压灭菌。TrisCl溶液的pH值随温度变化而变化，温度每升高1，pH值约降低0.03单位，配置及使用时需注意。2. 0.5M EDTA缓冲液（1L）pH 8.0称取EDTA-Na22H2O 186.1g，加入800mL重蒸水，磁力搅拌器搅拌，加入NaOH
29、调至pH 8.0，用重蒸水定容至1L。（注：只有在pH值接近8.0时，EDTA- Na22H2O才能完全溶解。调pH值时可以用固体NaOH，大约使用20g左右，也可以用10mol/L的NaOH溶液，大约使用70mL，待EDTA- Na22H2O完全溶解后再用稀NaOH准确调至8.0。）3. I号液（100mL）葡萄糖0.98g 、2.5mL 1M TrisCl、2mL 0.5M EDTA 2.0，加ddH2O定容至100mL。4. II号液（不灭菌）0.4M NaOH（100mL）和2%SDS等体积混合，新鲜配制。A、0.4M NaOH（100mL）：称取1.6g NaOH，dH2O定容至10
30、0mL。B、2%SDS（50mL）：称取2g SDS，dH2O定容至100mL。5. III号液（100mL，pH 4.8）先配100mL KAc（49.07g KAc定容至100mL）取60mL，冰乙酸11.5mL（pH 4.8），用dH2O定容至100mL。6. 10mg/mL 溶菌酶0.01g溶菌酶 + 1mL无菌水 + 10L 1M TrisCl7. TE（100mL）1M TrisCl 1mL + 0.5M EDTA 0.2mL，加dH2O定容至100mL。8. 3M NaAc（100mL）pH 5.2或pH 7.0称取40.8g NaAc3H2O溶于80mL dH2O中，用稀乙酸调
31、pH至5.2（7.0），定容100ml，高压灭菌。9. 10mg/mL 溶菌酶0.01g溶菌酶 + 1mL无菌水 + 10L TrisCl10. 胰RNA酶（20g/mL）2L胰RNA酶原液 + 1mL TE，分装七、 质粒的酶切鉴定【实验步骤】1. 按如下表所示向离心管中添加药品：10uL的反应体系20uL的反应体系10x buffer 1uL限制性内切酶 0.5uLDNA 0.5uLddH2O 8ul10x buffer 2uL限制性内切酶 1uLDNA 1uLddH2O 16ul2. 37（或其他酶的最适温度）孵育1-4小时。3. 电泳检测酶切结果。实验三 植物组织培养相关操作【相关名词
32、】1、外植体：在组织培养中培养对象的起始材料。2、培养基：在组织培养中用于给植物提供营养、固定植株的材料和试剂。3、无菌操作：在整个操作的进行过程中，材料所处的环境、所使用的试剂、器皿、器具都是无菌的，这样的操作过程称为无菌操作。4、接种：把培养材料放到培养基中或插到培养基上的操作。5、继代培养：把培养材料接种到新的培养基上继续培养。6、表面消毒：用消毒液把植物材料表面的微生物杀死，防止组织培养中污染的过程。【植物材料】1、 紫花苜蓿无菌苗。2、 烟草无菌苗。3、 温室栽培的紫薯。【仪器、器具、器皿及其他】1、 仪器：电子秤、pH计、磁力搅拌器（带搅拌子）、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌器、超净工作
33、台。2、 器具：移液器（吸头）、镊子、手术剪、手术刀（刀柄、刀片）。3、 器皿：量筒、塑料培养皿、塑料培养瓶、三角烧瓶、玻璃培养皿、称量皿。4、 其他：封口膜、酒精棉、滤纸等。【试剂配制】1、 培养基MSO培养基：称取4.74g MS培养基粉末和30g 蔗糖，加入装有900ml 蒸馏水的1L三角烧瓶中，加入搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌。待其溶解后，定容到1L，并用1N NaOH和1N HCl将pH值调到5.8。调好pH值后，加入8g 琼脂粉，用封口膜封号瓶口，等待灭菌。MB培养基：称取4.74g MS培养基粉末和30g 蔗糖，加入装有900ml 蒸馏水的1L三角烧瓶中，加入搅拌子，在磁力搅拌器上
34、搅拌。待其溶解后，加入1ml B5有机母液、NAA、6-BA并定容到1L，并用1N NaOH和1N HCl将pH值调到5.8。调好pH值后，加入8g 琼脂粉，用封口膜封号瓶口，等待灭菌。2、 消毒液70%酒精：用量筒量取700ml 95%医用酒精，加入200ml 蒸馏水，混合均匀即成。0.1% HgCl2：称取1g HgCl2，在三角烧瓶内溶于1L 蒸馏水中，用封口膜封号瓶口，等待灭菌。无菌水：装1L蒸馏水于三角烧瓶中，用封口膜封号瓶口，等待灭菌。【操作步骤】（一） 培养基准备1、 培养基灭菌 把高压蒸汽灭菌锅电源接通，确认锅内的水处于高水位；把培养基以及所有需要灭菌的试剂放入锅内，盖上锅盖，
35、设定灭菌时间（20min）、温度（121），打开气阀，开始灭菌。待锅内温度升到102以上，将气阀关闭，继续灭菌。灭菌时间到后，小心打开气阀，缓慢放气。待锅内热气排尽后，打开锅盖，把物品移到超净工作台中。2、 超净工作台消毒把超净工作台内的干热灭菌器电源打开（如果不用，则不用打开），把培养瓶/皿（或培养基）放入超净台内，打开超净台紫外灯，消毒2030min。之后关掉紫外灯，打开风机和照明灯备用。注意：以下的操作（除紫薯藤条的冲洗外）均为无菌操作，在超净工作台内操作前，应先用酒精棉把手擦净，进行表面消毒后方可进行。3、 培养基分装待培养基冷却到5060左右，把培养基均匀地分装到培养瓶或者培养皿中，
36、并在瓶、皿上做好标记。每升培养基可以倒20瓶/皿。（二） 紫花苜蓿的继代培养把干热灭菌器中的手术剪和镊子取出，晾凉备用；用少量无菌水玻璃培养皿的滤纸湿润备用。把装有紫花苜蓿无菌苗的培养瓶的外部用酒精棉擦净，打开盖子，用剪刀把紫花苜蓿齐根部剪断，用镊子取出，放到润湿的滤纸上。用剪刀剪去叶子，并把去掉叶子后的茎剪成段，每段留一个腋芽；用镊子把茎段接到塑料培养瓶内的MSO培养基上（生理下端插入培养基内），盖上瓶盖。每瓶接种46段。新接种的瓶子做好标记，放到光照培养室中培养。（三） 烟草叶片的再生诱导把干热灭菌器中的手术剪、镊子和手术刀取出，晾凉备用；用少量无菌水玻璃培养皿的滤纸湿润备用。把装有烟草无
37、菌苗的培养瓶的外部用酒精棉擦净，打开盖子，选长势好、比较嫩的叶片用剪刀从叶柄剪下，用镊子取出背面朝上放在润湿的滤纸上。用镊子固定住叶片，用手术刀小心把主叶脉去除。去除主叶脉的叶片，用手术刀切成3mm3mm的小片，背面朝下，放在培养皿内的MB培养基上，用封口膜封住培养皿，做好标记。放到光照培养室中培养。（四） 紫薯藤条的表面消毒和接种、培养把干热灭菌器中的手术剪和镊子取出，晾凉备用；用少量无菌水玻璃培养皿的滤纸湿润备用。1. 紫薯藤条的表面消毒：将温室中剪下的紫薯藤条用自来水洗净，并用吸水纸吸干（超净工作台外操作）。洗净的紫薯藤条剪成每段约35个腋芽的茎段，弃去叶子，放入烧杯中，倒入70%酒精直至藤条被完全浸没，消毒30sec，期间用镊子把藤条稍作晃动。倒掉酒精，加入0.1% HgCl2溶液至浸没，消毒8min，期间镊子把藤条晃动数次。倒掉HgCl2溶液，加入无菌水，剧烈晃动，漂洗3分钟。重复漂洗三次。2. 紫薯藤条的接种、培养：漂洗好的藤条放到事先准备好的用无菌水润湿的滤纸上，用剪刀剪去藤条两端受伤害的部分，把中间部分剪成数段，每段一个腋芽。用镊子把茎段接到塑料培养瓶内的MSO培养基上（生理下端插入培养基内），盖上瓶盖。每瓶接种46段。新接种的瓶子做好标记，放到光照培养室中培养。18
