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1、扩增基因全长实验技术,获取基因全长简介,基因初步验证,基因全长获取（RACE技术）,RACE产物鉴定,4,1,2,3,以介绍5RACE技术为主,5,对序列进行生物信息学分析,目录,为什么要获取基因全长？什么是EST？获取基因全长基本流程？,获取基因全长简介,EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5端和3端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等,平均长度为360 120bp 。,获取全长cDNA是研究基因功能的关键，是进行基因功能及产物分析的必
2、要前提。,获取基因全长基本流程,构建数据库,筛选EST序列,普通PCR进行初步验证,RACE技术,生物信息学分析,以本实验室具体情况为例子,生物信息学分析,Blast比对ORF比对相似序列多重比对家族成员多重比对,PCR扩增,凝胶回收,测序,设计引物提取RNA反转录PCR扩增,电泳检测凝胶回收电泳检测克隆,PCR产物测序凝胶回收测序克隆后菌液测序克隆后质粒测序,基因初步验证,RACE技术,方法,RACE 简介,试剂盒选取,5RACE原理,实验过程,基因全长获取,cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分c
3、DNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法。,分为3RACE 和5RACE,RACE 简介,Clontech公司,全称：SMART RACE cDNA amplification kit,优点：操作简便，成功率较高，全长分子的比例较高,价钱：中等偏上。,缺点：不知道能否拿到完整的5UTR.,试剂盒选取,5RACE原理,5,polyA 3,Oligo(dT)primer,5,polyA 3,cDNA第一条链合成机制,polyA 3,polyA 3,3,5,5RACE原理,polyA 3,5,3,LUP,Suppression PCR:阻抑聚合酶反应,5,3,5,3,3,5,GSP1,3,GSP1
4、,SUP,5,5,3,5,3,实验过程,合成cDNA第一条链,（1）制备A管：加好后放在室温下。共计4ul。 2.0ul 5X First-Strand Buffer 1.0ul DTT(20 mM) 1.0ul dNTP Mix(10 mM) 4.0ul Total Volume,（2）制备B管：冰上操作。 1.0-2.75ul RNA 1.0ul 5-CDS Primer A 再加入无菌水，使体积达到3.75ul。 混合溶液，并用掌上离心机离心。72 3分钟，42 2分钟。此过程可在PCR仪中进行。之后14000g离心10s。如果是做5RACE，则加入1ul SMARTer IIA oli
5、go。 此时B管体积为4.75ul。,实验过程,合成cDNA第一条链,（3）在上一步放入PCR仪中后，在之前放在室温下的A管中加入：（室温进行）0.25ul RNase Inhibitor(40 U/l) 1.0ul SMARTScribe Reverse Transcriptase(100 U)加上之前A管中的4ul，此时总体积为5.25ul。,（4）将A管中的混合液体5.25ul加入到B管4.75ul中。使体积达到10ul。缓慢吸打混合，离心至管底部。之后将管放在PCR仪中4290分钟。7010分钟。（5）在管中加入Tricine-EDTA Buffer 100ul。（在总RNA的浓度20
6、0ng时） -20保存3个月。,RACE PCR,每50ul的体系中先合成41.5ul的Master Mix: 34.5ul PCR-Grade Water 5.0ul HiFi PCR Buffer 1.0ul dNTP 1.0ul HiFi Mix,实验过程,PCR反应体系： 5RACE ready cDNA : 2.5ul UPM（10*）：5ul GSP1（10uM）：1ul Master Mix：41.5ul Total：50ul,实验过程,RACE PCR,PCR反应程序： 94 3min 30cycles 94C 30 sec 68C 30 sec 72C 3 min 72 10min 4 +,4种方法,凝胶回收,对PCR产物进行凝胶回收，确认片段大小，对回收产物进行测序。,产物位置、大小,比较GSPs和NGSPs作为引物时扩增得到的产物。,克隆测序,对RACE产物进行克隆测序，建议选取8-10个克隆进行测序。,Southern Blot,对Southern杂交结果进行分析,RACE产物的鉴定,谢谢,
