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1、多聚酶链式反应(PCR),一、PCR技术概念：是一种体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用：,DNA复制原理,在80100C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性,当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链;, PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器.,二、PCR技术的原理,DNA双链,单链,变性（加热95 ）,复性（缓慢冷却55 ）,4、DNA 分子的热变性原理：,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物和引物与两条单链的结合,三、使用PCR的前提是：已知
2、目的基因(或DNA片段)两侧的序列，根据该序列化学合成反应必需的双引物。,PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。,四、 PCR条件： 四种脱氧核苷酸;耐高温的DNA聚合酶;两种引物; 模板；缓冲溶液严格控制温度的温控设备。,DNA的复制 体外的模拟,模板（母链） 细胞内源 外源加入解旋 解旋酶 加热变性引物 引物合成酶 外源加入底物 细胞内源 外源加入DNA聚合酶 细胞内源 外源加入反应环境 细胞内环境 缓冲液,-OH端为3 磷酸基团的末端为5,复制的方向：子链的5 端向 3端延伸,DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在100 0C条件下，能保持几个小时。
3、而其最适温度在72 0C左右。,引 物 引物是决定PCR结果的关键。 * 引物长度以1530个碱基为宜，引物过长会影响与模板的退火效率。 * (GC)含量最好保持在约40%60%， (GC)含量越高退火温度越高，退火温度过高过低都不利于PCR的反应。,* 两个引物之间不应发生互补。 * 引物浓度要适宜. 用低浓度引物不仅经济，反应特异性也较好。,快速、 高效、灵活、易于操作,五、 PCR技术的特点,六、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别,体内DNA复制和PCR不同点,解旋（解旋酶；高温解旋）引物（RNA；人工合成的DNA单链）DNA聚合酶（耐不耐高温）反应环境（细胞内环境；缓冲溶液）,六、 P
4、CR的反应过程,1、PCR的反应步骤,PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸,变性（模板DNA解旋）,模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备.,2、循环过程,复性（退火）,模板DNA经加热变性成单链后，温度降到550C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合,延伸,DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链.,3、30次循环后靶序列扩增的数量,七、PCR
5、 循环的结果, DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增;,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸;,八、 PCR 的实验操作,1、PCR仪,（一）设备及用具,实质上一台能够自动调控温度的仪器,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,PCR仪,（二）、PCR的反应过程,每个循环包括：变性 复性延伸,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的D
6、NA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,PCR循环-变性,PCR循环-变性,PCR循环-变性,PCR循环复性,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR整个过程,反应程序,95 5分钟，1个循环； 95 30秒，55 30秒，72 1分钟，30个循环； 72 延伸7分钟。 反应产物在4保存。反应结束后用紫外分光光度计测定扩增产物的DNA含量或用琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。,讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度,为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板延伸的温度必须大于
7、退火温度，而小于变性温度 DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶,紫外分光光度计测定PCR产物含量,将PCR产物10倍稀释后，用蒸馏水做空白对照，在260nm处测定稀释后PCR产物的吸光值（A260nm），根据下面的公式计算DNA含量。,1 g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02。,1 2 3 M 4 5,PCR产物 的琼脂糖凝胶电泳,1，2，4，5：PCR产物；3，阴性对照；M,DNA分子量标准（从上向下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）,PCR技术与体内DNA复制的区别：,1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；,
8、2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；,3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。,练习巩固,1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定,2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？,3、PCR技术最突出的优点是A 原理简单 B 原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作,4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸
9、馏水使用前必须进行的关键步骤是A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染C 高压灭菌 D 在20 储存,实验小结,PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,模板,互补,Taq聚合酶,四种脱氧核苷酸,引物,变性、复性和延伸,72,三、实验步骤：,准备好PCR
10、反应体系的配方,1、准备,2、移液,（二）实验操作步骤,按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上,用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂,过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁,注意：,3、混合,B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀,A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢,将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序,过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s,4、离心,5、反应,离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果,PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：,注意事项,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头.,
