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1、高效液相色谱柱基础知识,张润平,色谱柱的构造,色谱柱由柱管、填料压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70 kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管。为提高柱效，减小管壁效应，管内壁要求有很高的光洁度，不锈钢柱内壁多经过抛光。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.220m(510m)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。,按用途分类分析型常规分析柱，内径25mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长1030cm,粒径3.5或5m，；窄径柱（又称半微柱semi-microcolumn），内径12mm，柱长1020cm；
2、毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.20.5mm；制备型半制备柱，内径5mm；实验室制备柱，内径2040mm，柱长1030cm；生产制备柱，内径可达几十厘米。,色谱柱的种类,按分离机制分类吸附型色谱柱化学键合相色谱柱(分配型）正相键合相色谱柱反相键合相色谱柱离子交换色谱柱凝胶色谱柱亲合色谱柱手性色谱柱,色谱柱的种类,色谱柱的种类,按填料基质分类硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。具有高强度，不会在溶剂中收缩或膨胀。能提供一个含有游离硅羟基的表面，可以通过硅烷化技术键合上各种配基，制成正相、反相、离子交换、分子排阻色谱用填料。适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中
3、不稳定，易溶解。,高分子聚合物常用的是以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的球形填料。压力限度比无机填料低；在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱 ；聚合物基质在流动相发生变化时会出现膨胀或收缩，对于小分子化合物柱效低；主要用于大分子化合物，常制成凝胶柱或离子交换柱。,色谱柱的种类,化学键合相色谱柱,定义：将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。 种类非极性键合相（反相）：键合相表面基团为非极性羟基，如C18、C8、C3、乙基、甲基与苯基。中等极性键合相：常见的为醚基和二羟基键合相，既可做正相又可做反相色谱的固定相，视流
4、动相极性而定。极性键合相（正相）：常用的为氨基、氰基、二醇基键合相。,化学键合相色谱柱的合成,化学键合相一般采用微粒多孔硅胶为基体，用烷烃二甲基氯硅烷或烷烃氯硅烷与硅胶表面的游离硅羟基反应，形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。由于空间位阻效应和其它因素的影响，使得大约有4050%的硅醇基未反应。残留硅羟基可以减小非极性键合相表面的疏水性，对极性溶质（特别是碱性化合物）产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化，使碱性组分的峰形拖尾。,化学键合相色谱柱的合成,端基封口：为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理，称端基封口，以提高键合相的稳定性，改善脱
5、尾。键合相的键合量常用含碳量(C%)或覆盖度来表示。覆盖度：指参与反应的硅羟基数目占硅胶表面硅羟基总数的比例。除硅碳杂化硅胶外，一般硅胶基质的pH适用范围为pH28，低pH引起键合相水解脱落，高pH引起硅胶溶解。,化学键合相色谱柱的合成,基质的性质普通硅胶填料：pH28，柱温60聚合物填料：pH212，柱温150杂化硅胶填料（XTerra,XBridge）：pH212，柱温90Agilent柱：Ecilpse或StableBond ，pH13 ZORBAX Extend-C18，pH912,基质的颗粒度颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)，分离度越好，柱压越高(渗透性差)，常用5。基质的
6、颗粒分布颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差)基质的颗粒形状球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型（不规则形状）：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀，谱带扩展。,化学键合相色谱柱的性质,基质的平均孔径/孔体积,平均孔径与被测物分子量的关系,化学键合相色谱柱的性质,含碳量含碳量越高，保留时间越长高含碳量 有利于不易保留的化合物的分离 水解稳定性好，重现性好 有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量 有利于分析中性及碱性化合物 降低溶剂损耗,化学键合相色谱柱的性质,硅胶的活性 主要影响碱性化合物的保留行为，活性高，保留时间长 生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量
7、重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 是色谱柱质量好坏的重要标志端基封口 未封口会使碱性化合物拖尾备注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂。,化学键合相色谱柱的性质,键合相的性质 键合相的极性：非极性、中等极性、极性 键合相的烷基链长非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。长的烷基链保护了
8、硅胶基质，C18柱稳定性较高；C18基团空间体积较大，使有效孔径变小，分离大分子化合物时柱效较低。,化学键合相色谱柱的性质,键合相的性质 内嵌极性基团键合相（SymmetryShield RP、Bonus-RP）,化学键合相色谱柱的性质,屏蔽了带电的硅羟基,降低碱性物质的保留减少了拖尾改善与水的浸润性无疏水塌陷，使用高比例水流动相时性能稳定,反相键合相色谱,适用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。派生的反相离子对色谱以及离子抑制色谱，可以分离有机酸、碱、盐这些离子型化合物。样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；短链烷基键合相具有较高的覆盖度，
9、分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。,流动相为极性的水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。极性大的保留时间小，先洗脱。 分离机制：疏溶剂理论,反相键合相色谱,正相键合相色谱,适用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氰基键合相分离选择性与硅胶相似，极性小于硅胶，在相同条件下，同一组分的保留时间小于硅胶。氨基键合相具有较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力；氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用，故被广泛用于糖类的分析，但它不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等，因为它们之间会发生反应生成Schiff 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。,流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。在正相色谱中，溶剂的洗脱强度随极性的增强而增加； 极性小的样品保留时间小，先洗脱。分离机制：范德华作用力,主要是氢键作用力。,正相键合相色谱,正相色谱法与反相色谱法比较表,化学键合相色谱,
