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1、实验二、纸层析法分析氨基酸,一、实验目的1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性颜色反应。3.学会分析未知样品的氨基酸成分。,纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。,二、实验原理,常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相, 一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力, 其吸附
2、的水相为固定相, 有机溶剂相为移动相。 由于物质的极性大小不同,在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多,随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多,移动相对较慢,从而将极性不同的物质分开,纸上层析的原理,在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。 Rf值的定义为： 原点到层析斑点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离,影响Rf值的因素有： 物质本身的化学结构； 展层所用溶剂系统； 展层剂pH值； 展层时的温度； 展层所用滤纸； 展层的方向(横向，上行或下行)。用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行
3、鉴定。,三、实验操作 1、纸的处理 取18 cm长、18 cm宽的滤纸一张，离底边2 cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈，使圈的直径小于0.4 cm。 2、点样 用毛细管点样，中间点混合氨基酸，两侧点三种标准氨基酸；每个点样点重复点2-3次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在2-4mm左右，点样完毕用大头针线将滤纸做成筒形，点样面向里。,图1. 点 样,2cm,展层剂,图2. 滤纸的缝合,3、平衡 点样以后将滤纸与层析缸用配好的溶剂系统蒸汽来饱和，这个过程称为平衡(30min) ,否则，滤纸会从溶
4、剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组分发生改变，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿，影响层析效果。 4、展层 向层析缸中加入层析溶剂（高约1.5cm） ，液层不要超过点样线，将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达滤纸上边线1-2cm时取出冷风吹干。,5、显色 用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，热风吹干(加快反应)反应显色(或晾干后，将滤纸放入烘箱中80-100，烘烤5分钟后 )，滤纸上即显出紫红色或黄色的氨基酸斑点。 四、结果处理 1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来。 2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种已知氨基酸和未知氨基酸色谱的Rf值。 3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。,图3. 层析谱1原点；2层析点；3溶剂前沿,五、注意事项 (1) 在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 (2) 在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3) 点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点重叠。(4) 展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与滤纸平行。(5) 吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 (6) 展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。,
