常用的分子生物学技术原理及应用ppt课件.ppt

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1、2022/12/25,Suzhou University,1,常用分子生物学技术的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application,2022/12/25,Suzhou University,2,第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology,2022/12/25,Suzhou University,3,定义：核酸分子杂交 (nucleic acid ybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放

2、在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。,一、分子杂交与印迹技术的原理,2022/12/25,Suzhou University,4,复性,RNA,DNA,2022/12/25,Suzhou University,5,（一）印渍技术 Blotting,首先由Edwen Southern在1975年提出。Blotting即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质，并加以检测分析的技术，目前广泛应用于DNA、RNA和蛋白质的检测.,2022/12/25,

3、Suzhou University,6,（二）探针技术 probe,将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记，称为“探针”然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。,2022/12/25,Suzhou University,7,1、探针的制备方法,探针长度一般以50300bp为宜。制备方法：1）利用DNA重组技术2）PCR扩增3）化学合成,2022/12/25,Suzhou University,8,2、探针的分类： 据制备方法及核酸性质不同，可分为：（1）基因组DNA探针（2）cDNA探针（3）RNA探针（4

4、）寡核苷酸探针,2022/12/25,Suzhou University,9,3、合成寡核苷酸探针注意原则：,1）长度（10-50 bp); 2) G:C对含量40%-60%；3）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。,Home,2022/12/25,Suzhou University,10,4、核酸探针的标记,为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。,2022/12/25,Suzhou University,11,（1）标记的种类,同位素： 32P、35S、3H、12

5、5I等标记探针非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。,2022/12/25,Suzhou University,12,2022/12/25,Suzhou University,13,（3）一个理想的标记物：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。,2022/12/25,Suzhou University,14,（4）探针的标记方法,1）缺口平移法2）随机引物标记法3）末端标记法4）生物素光照标记法,2022/12/25,Suzhou Univer

6、sity,15,Nick Translation,2022/12/25,Suzhou University,16,随机引物标记探针,2022/12/25,Suzhou University,17,3、DNA末端标记,2022/12/25,Suzhou University,18,（三）印渍技术的类别及应用,DNA印迹技术 Southern blottingRNA印迹技术 Northern blotting蛋白质印迹技术 Western blotting 斑点印迹 Dot blotting原位杂交 in situ hybridization DNA点阵 DNA array DNA芯片技术 DNA

7、 chip,2022/12/25,Suzhou University,19,1、DNA印迹技术 Southern blotting,（1）定义：又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。,2022/12/25,Suzhou University,20,2、基本方法,将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段；经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸

8、纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,2022/12/25,Suzhou University,21,Paper Towels,Southern Blotting,tissue,SDS,蛋白酶K,酚/氯仿,无水乙醇离心,2022/12/25,Suzhou University,22,。,2022/12/25,Suzhou University,23,真空转膜,2022/12/25,Suz

9、hou University,24,2022/12/25,Suzhou University,25,2022/12/25,Suzhou University,26,（2）RNA印渍技术 Northern blotting,又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,2022/12/25,Suzhou University,27,（3）蛋白质印渍技术Western blotting,又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利

10、用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。,2022/12/25,Suzhou University,28,Western Blot,2022/12/25,Suzhou University,29,Western blot,化学显色复合物,ABC复合物,2022/12/25,Suzhou University,30,三种印迹技术的比较,2022/12/25,Suzhou University,31,DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质

11、粒和噬菌体的分析。,RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。,蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,2022/12/25,Suzhou University,32,（4）斑点印迹 Dot blotting,斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。,2022/12/25,Suzhou University,33,DNA 样品,2、应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析,点样,Probe-32

12、P,检测,AB,1 2 3 4,2022/12/25,Suzhou University,34,（5）原位杂交 in situ hybridization,即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。,2022/12/25,Suzhou University,35,第二节 生物芯片（biochip）,制备方法及点样仪器,探针的制备：标记方法杂交：杂交液、杂交温度、洗涤条件的选择,扫描仪:激光 CCD,分析软件的开发,基因芯片的制

13、备,杂交,检测,数据分析,2022/12/25,Suzhou University,36,一、定义 指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,2022/12/25,Suzhou University,37,二、生物芯片的种类,DNA芯片：又称DNA芯片,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布

14、来进行分析。蛋白质芯片：利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。 其它芯片：,2022/12/25,Suzhou University,38,三、发展过程,Southern & Northern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,2022/12/25,Suzhou University,39,四、芯片的制备,（一）支持物的预处理1、实性材料：硅芯片、玻片和瓷片 需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。2、膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维 膜，通常包被氨基硅烷或多聚赖

15、氨酸,2022/12/25,Suzhou University,40,(二) 芯片制备方法,（1）原位合成（in situ synthesis） 光导原位合成法 原位喷印合成 分子印章多次压印合成 （2）点样法,2022/12/25,Suzhou University,41,原位合成(In Situ Synthesis),2022/12/25,Suzhou University,42,合成后交联,方式：预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上探针的制备：已克隆的基因片段PCR，RT-PCR扩增的基因片段人工合成的DNA片段单链、双链、DNA或RNA 均可作为探针,2022/12/25,Su

16、zhou University,43,五、样品的准备,样品的分离纯化DNA , mRNA扩增PCR, RTPCR，固相PCR标记等过程荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素、放射性标记,2022/12/25,Suzhou University,44,六、分子杂交,样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别：杂交时间短，30分钟内完成可同时平行检测许多基因序列影响杂交反应的因素：盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构,2022/12/25,Suzhou University,45,肽核酸( peptide nucleic acid , PNA)是一类以氨基酸替代糖-磷酸主链的DN

17、A类似物，骨架由重复的N-甘氨酸通过酰胺键相连构成，碱基则通过甲叉碳酰基与骨架相连。PNA分子内不会形成二级、三级结构DNA与PNA杂交不需要盐离子,2022/12/25,Suzhou University,46,七、检测分析,激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号软件进行进行图象分析和数据处理,2022/12/25,Suzhou University,47,2022/12/25,Suzhou University,48,DNA测序；杂交测序（SBH）基因表达分析：基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因

18、及在RNA水平上检测致病基因的表达药物研究与开发：,八、DNA芯片技术的应用,2022/12/25,Suzhou University,49,cDNA microarray expression patterns of small (S) and large (L) neurons,2022/12/25,Suzhou University,50,基因表达谱（gene expression pattern),BiologicalSample,Functional Information,红色 上调黄色 不变绿色 下调,2022/12/25,Suzhou University,51,基因芯片的优点

19、：高通量大规模高度平行性快速高效高灵敏度高度自动化,2022/12/25,Suzhou University,52,第三节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction,2022/12/25,Suzhou University,53,PCR技术 polymerase chain reaction,PCR即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。,2022/12/25,Suzhou

20、 University,54,2022/12/25,Suzhou University,55,PCR,Step1 变性,Step2 退火,2022/12/25,Suzhou University,56,ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,TTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAA,Step3 : Extension 延伸,72C,CGTAGTAGCA,GCTGCTACGTAG,TAGCAATGTACATCATCAGAT

21、AGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA,2022/12/25,Suzhou University,57,一、原 理：,1) 合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；2) 反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer3) 反应程序： 变性 ( 9495oC) 复性 延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸10min 30-35cycles DNA扩增100万倍,2022

22、/12/25,Suzhou University,58,PCR扩增,2022/12/25,Suzhou University,59,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+,二、PCR体系基本组成成分,2022/12/25,Suzhou University,60,1、引物设计原则,1）引物的特异性2）避开产物的二级结构区3）长度寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。4）G+C含量一般为40%60%。Tm=4（G+C）+2（A+T）5）碱基础随机分布：3端不应超过3个连续的G或C6）引物自身，引物之间无二级结构8）引物的3端：不可以修饰9）引物的5端：可以被修饰，

23、包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛。10）密码子的简并,2022/12/25,Suzhou University,61,2、Taq酶普通Taq酶Pfu Taq酶Pfu能纠正DNA扩增（PCR）过程中产生的错误，而传统的Taq DNA Polymerase, Tth DNA Polymerase 及它们的突变体如AmpliTaq, KlenTaq等都不能。它比Taq DNA Polymerase及突变体低10倍，比Vent 和Pwo低2-4倍，比UlTma低30倍。 Kod Taq酶是toyobo公司专利产品，世界最高保真水平的PCR酶。长片段Taq酶,2022/12/25,Suzhou

24、 University,62,三、PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,如何确定PCR循环参数？,2022/12/25,Suzhou University,63,四、PCR的主要用途,（一）目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA 获得已知目的基因片段；利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。,2022/12/25,

25、Suzhou University,64,（二）基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。（三）DNA和RNA的微量分析 由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析检测。 （四）DNA序列测定（五）基因突变分析,2022/12/25,Suzhou University,65,PCR特点及应用：,优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。应用：（1）基因组DNA分析；（2）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断。缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。,2022/12/

26、25,Suzhou University,66,五、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术（二）反向PCR（三）RAPD PCR（四）原位PCR技术（五）实时PCR技术,2022/12/25,Suzhou University,67,PCR相关技术：,1）增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题： 一是形成引物二聚体，一是非特异扩增.消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。 对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经1

27、520个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。,2022/12/25,Suzhou University,68,2)巢式PCR（nest PCR）,此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。,2022/12/25,Suzhou University,69,在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火

28、温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。,3)多重PCR,2022/12/25,Suzhou University,70,4）RT-PCR,RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ngg水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。,2022/12/25,Suzhou University,71,RT-PCR需注意RACE技术,2022/12/25,Suzhou University,72,RT-PCR,cDN

29、A,2022/12/25,Suzhou University,73,5）单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）,是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。,2022/12/25,

30、Suzhou University,74,PCR-SSCP过程,2022/12/25,Suzhou University,75,6）差异展示反转录PCR (differential display reverse transcriptase PCR ，DDRT-PCR),Liang P. (1992)建立此法，用来分离变异细胞中的特异RNA，它可用来由少量mRNA产生cDNA,以鉴别细胞间的表达差异。DDRT-PCR的关键是采用经修饰的寡聚dT；引物用于反转录，即polyA+mRNA 在引物的3端的双核苷酸的差异退火 。,2022/12/25,Suzhou University,76,2022

31、/12/25,Suzhou University,77,2022/12/25,Suzhou University,78,反向PCR,2022/12/25,Suzhou University,79,7）实时PCR技术原理,2022/12/25,Suzhou University,80,第 三 节核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis,2022/12/25,Suzhou University,81,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法 (Maxam-Gillbert法),DNA链的末端合成终止法 (Sanger法),2022/12/25,Suzhou Un

32、iversity,82,一、化学裂解法(Maxam-Gilbert法),基本原理,基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。,2022/12/25,Suzhou University,83,化学裂解法的示意图,2022/12/25,Suzhou University,84,二、DNA链末端合成终止法,2022/12/25,Suzhou Universit

33、y,85,目 录,2022/12/25,Suzhou University,86,三、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,2022/12/25,Suzhou University,87,DNA自动测序结果举例,目 录,2022/12/25,Suzhou University,88,基 因 文 库Gene Library

34、,第 四 节,2022/12/25,Suzhou University,89,基因组DNA文库 (genomic DNA library)cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,2022/12/25,Suzhou University,90,基因组DNA文库,cDNA文库,2022/12/25,Suzhou University,91,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,2022/12/25,Suzhou University,92,筛选cDNA文库,1. 合成寡核苷酸探针；

35、 由于密码子的兼并性我们无法确定一个肽链的cDNA序列，但我们可采取以下策略： （1）.兼并寡核苷酸探针； 设计一组涵盖可编码一段给定氨基酸序列所有可能的DNA探针，一般使用最短长度(1417 Nt)（2）.用每个氨基酸最常用的密码子合成单一的较长的DNA探针(4060Nt),不使用CpG,因它出现得少。此探针虽不会和cDNA完全配对，但在非严格条件下可杂交，并足以检出靶DNA。,2022/12/25,Suzhou University,93,2. 抗体探针： 用标记的抗体探针和印有细菌裂解碎片的纤维膜杂交。关键是抗体的质量，它必须能识别结合变性蛋白(即能在Western印迹上产生强信号)3.

36、扣除探针(subtracted cDNA probe),2022/12/25,Suzhou University,94,抑制扣除杂交(suppression subtraction hybridization ,SSH),Siebert P.等于1992年建立的，此法作为一种克隆差异表达基因转录的方法。 先启动过量的驱动cDNA序列和2个标准的待测cDNA池快速反复结合，随着驱动-待测杂交反应，混合2个待测池,2022/12/25,Suzhou University,95,2022/12/25,Suzhou University,96,2022/12/25,Suzhou University,

37、97,2022/12/25,Suzhou University,98,疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes,第 五 节,2022/12/25,Suzhou University,99,克隆疾病相关基因的策略,（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略(positional candida

38、te gene approaches ),2022/12/25,Suzhou University,100,1定义： 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。,（一）功能性克隆,2应用： 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。,3克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。,2022/12/25,Suzhou University,101,（二）定位克隆,1、定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。,2、系统的定位克隆工作 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)：交换分析、连

39、锁不平衡分析 分子生物学分析：染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆,2022/12/25,Suzhou University,102,（三）非定位候选基因克隆策略,由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。,2022/12/25,Suzhou University,103,（四）定位候选基因克隆策略,当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。,2022/12/25,Suzhou University,104,第 六 节遗传修饰动

40、物模型的建立及应用,The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model,2022/12/25,Suzhou University,105,转基因技术（动物）采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因被导入的目的基因转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物,一、转基因技术,2022/12/25,Suzhou University,106,2022/12/25,Suzhou University,107,2022/12/25,S

41、uzhou University,108,2022/12/25,Suzhou University,109,核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,二、核转移技术,2022/12/25,Suzhou University,110,基因剔除技术也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。,三、基因剔除技术,2022/12/25,Suzhou University,111,四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用,建立动物模型 单基因决定疾病模型 基因剔除获得性突变(gain-

42、of-function mutation) 多基因决定疾病模型,2022/12/25,Suzhou University,112,第 七 节 生 物 芯 片 技 术,Biological Chip Technology,2022/12/25,Suzhou University,113,DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),2022/12/25,Suzhou University,114,2022/12/25,Suzhou Un

43、iversity,115,DNA微阵列,2022/12/25,Suzhou University,116,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(protein chip),2022/12/25,Suzhou University,117,第 八 节蛋白质相互作用研究技术,Research Technology of Interaction of Protein,2022/12/25,Suzhou University,118,蛋白质之间相互作用以及通

44、过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,1、蛋白质之间相互作用研究的重要性,2022/12/25,Suzhou University,119,酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等,2、常用蛋白质相互作用的研究技术,2022/12/25,Suzhou University,120,1）酵母双杂交技术,2022/12/25,Suzhou University,121,2）酵母双杂交系统的应用,（一）分析

45、已知蛋白之间的相互作用（二）对蛋白质功能域的分析（三）分析未知蛋白相互作用（四）绘制蛋白质相互作用系统图谱（五）在药物设计中的应用,2022/12/25,Suzhou University,122,2）荧光共振能量转移（FRET）是比较分子间距离与分子直径的有效工具。FRET对距离和荧光基团的空间取向有高度敏感性，可以通过荧光能量转移效率的测量，观察生物分子间相互作用的改变情况，研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，在蛋白质蛋白质相互作用研究、酶活性分析等方面有很重要的应用。FRET发生的基本条件是：供体D和受体A的距离必须达到一定的数量级（1-10 nm）；受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱

46、相重叠；供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似平行。,2022/12/25,Suzhou University,123,3） 噬菌体展示,很多重要分子间相互作用是发生在蛋白质(如细胞表面受体)和一种扩散性小分子(如配基)之间,酵母双杂交显得无能为力；对这一类受体蛋白cDNA文库的筛选George Smith等发展了一种方法，用M13表达噬菌体衣壳融合蛋白,这种蛋白可以共价连接的方式附着在塑料盘子的底部。由于融合蛋白是在噬菌体的外侧表达的，是否能结合到塑料盘子上就可将噬菌体分开。,2022/12/25,Suzhou University,124,方法：(1)将随机的多肽DNA弹夹(random

47、peptide DNA cassette)插入到基因III的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面出现各种不同的蛋白质和多肽，即多肽文库。(2)然后通过免疫吸附或亲和层析分离出特定的目标噬菌体。(3)扩增阳性噬菌体。(4)用ELISAs 进行分析鉴定。,2022/12/25,Suzhou University,125,2022/12/25,Suzhou University,126,2022/12/25,Suzhou University,127,第九节报道基因(Reporter genes),通过检测mRNA转录本的水平或蛋白质的水平来了解基因的表达情况总是不方便的。如通过检测大量的缺失和点突变及

48、转染细胞来鉴别基因的调控顺序就更不方便。利用报道基因可较容易地达到此目的。报道基因能用来鉴定细胞，组织或顺式元件的短暂作用，或它对外来刺激(如激素)的反应。,2022/12/25,Suzhou University,128,1、报道基因的条件,报道告基因编码的蛋白活性不能和靶细胞中已存在的某种蛋白相似。所编码的酶的活性测定应快速，简便，灵敏，特异，且重复性好。报道蛋白的功能不会干扰细胞的正常活性，如信号转递，代谢速率等。,2022/12/25,Suzhou University,129,2、体外报道基因分析的方法,(1)氯霉素乙酰转移酶 (CAT)它催化乙酰基从乙酰辅酶A上转移到氯霉素上，使氯

49、霉素被乙酰化而失活，籍此来保护细菌。几乎所有的真核细胞中都没有相似的酶的活性。从转染细胞的提取物中用14C标记的氯霉素温育转染细胞的提取物和薄层层析可以很容易地分析CAT的活性。 但本法用同位素价格昂贵，CAT的稳定性也不理想。,2022/12/25,Suzhou University,130,pBasic,pBasic,pAMG,pAMG,pCMV,pCMV,巨细胞病毒,多克隆位点,2022/12/25,Suzhou University,131,(2) 荧光素酶(Luciferase, luc),luc基因来自荧火虫(Photinus pyralia), Luc的底物是荧光素，催化反应需A

50、TP，Mg2+。用一种特殊的设计的发光计可量度荧光素经ATP依赖性Luc催化发出的荧光。,2022/12/25,Suzhou University,132,(3)-葡糖醛酸酶 (-glucuronidase,GUS),GUS是一种细菌的酶，在植物和哺乳动物细胞中都可用作报道基因，但因大多数植物缺乏内源性葡糖醛酸酶，故更适合用GUS。它不会影响高等植物的生长发育。GUS的优点之一是有多种分析方法：用Xgluc为底物对表达GUS的细胞和组织进行组织化学染色。用4MUG(4-甲基荧光素 D半乳糖苷)作底物进行GUS荧光分析，此法较灵敏。以金刚烷基1,2-二氧杂环芳香基葡糖醛酸为底物可进行GUS化学发