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1、方法学验证中各项指标的深度剖析,一、线性试验,主成分含量测定 以测定浓度为100% ，50%120%之间选取5个点即可。 溶出（释放）度测定 以释放量的10%120%间选取5个点即可。 杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限度为100% ，50%120%之间选取5个点即可。,测定结果：1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。2）误差在哪里，应用时的注意事项。3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的原理知晓。,唑 来 磷 酸 结 构 式,引申使用：1）有关物质测定 归一化法和自身对照法
2、的相互妙用。2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定为中间浓度。举例说明。3）回收率试验为何做80%120%即可？亦及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理解。4）国内只注重相关系数，不注重截距。,二、精密度试验,重复性试验：连续进样6次。 中间精密度试验和重现性试验通过“耐用性试验中的溶液稳定性试验”来体现。 浓度极低时才会不理想，加大进样量。 色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被测物质峰尽快出峰。,三、准确度试验 用回收率来衡量,作法：在80%120%间选择3点或5点，原因是由外标一点法决定的。 已知杂质、且有杂质对照品的，可采用加入法，即加样回收率来
3、评价。 一般情况下，只要空白辅料无干扰，回收率均是良好的！,四、专属性,有关物质为主，其他检测项目（含量）基本上均参照有关物质。 有关物质的验证，采用中间体和降解产物（确认结构后人工合成）来验证与主成分的分离。,系统适用性试验的配制方法： 在100浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。 介绍配制方法 先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！,专属性试验验证图谱,存在问题 配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤然加大，将杂质峰覆盖。 强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分
4、离、测定。, 检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得到错误的判断。,介绍该项检测的由来和历史背景 要看主峰里是否有杂质，如何判断？但需注意DAD检测器的局限性，介绍“土办法”！ 结果：目前从来没有推翻现行色谱条件的。意义在哪里。如何应用，拿到只是“走形式”？,最小峰面积的设定 其设定
5、，不是绝对值，而是相对值。 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10 1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。 原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。,强力破坏试验 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90放置24小时。 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90放置24小时。 强碱破坏 取原料适量
6、，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90放置24小时。 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90放置24小时。 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。,四、检测限, 信噪比的三倍 纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。 是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。,有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系,积分参数的设定 积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 采用自身对照法时，对
7、照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。 供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大，又将反映不出杂质情况。,方法学认证中的耐受性试验 是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这一点才是真正至关重要的！认证时不可能做到这一点，出现问题时往往要考虑到。,方法学认证中溶液稳定性的全面判定不能单从主成分入手！还要注意所有组分的百分比变化，绝对值变化！,流速、柱温与溶剂的选择 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成
8、分峰不拖尾即可。 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35。 溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。,质量标准中制订有关物质的原则 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规定。 不采用任何方式。,典型强破坏试验图谱,药品含量测定方法的设计原料药,原料药:
9、对于组份单一的原料药,首选容量法测定含量 强调：（1）供试品的取用量应满足滴定精度的要求（消耗滴定液约20ml）；（2）滴定终点的判断要明确，如选用指示剂法，应考虑其变色敏锐，提供滴定曲线，并用电位法校准其终点颜色。（3）为排除因加入其它试剂或混入杂质对测定结果的影响，或便于剩余滴定法的计算，可采用“将滴定的结果用空白试验校正”的办法；（4）最后要给出滴定度（采用四位有效数字）。,容量法测定含量要注意参加反应的应是药物分子活性部分，而不应是次要的酸根或碱基部分。 如盐酸氨溴索 ，有研究者采用氢氧化钠滴定液测定其含量，事实上这种方法测定的是其中盐酸的含量，由于其成盐工艺中的酸、碱配比不当时，可严
10、重影响成品酸碱度，故测定结果并不能代表其活性成分有机碱的含量 。 应采用非水滴定法，以无水冰醋酸为溶剂屏蔽掉盐酸的干扰，用高氯酸滴定其有机碱的含量。高氯酸非水滴定法因适应性广（适用于有机弱碱及其盐类）在化学原料药的含量测定中较为常用。,如用容量法不适宜时，可考虑选用HPLC法，尤其在有关物质干扰，或多组份物质时，具有特殊优势。一般不选用UV法，尤其不首选“吸收系数法”定量，不选用末端吸收峰作测定波长；须用UV法时，可采用不受仪器及其它变化影响的“对照品比较法”定量，测定溶液的吸收度宜在0.30.7间。元素测定法如定氮法，在其它方法均不适宜时可采用，但因不能反映化合物含量的变化情况，此法不可用于
11、稳定性考察中。,药品含量测定方法的设计制剂,应考虑辅料等的干扰，首选方法一般为HPLC法，在有关物质、辅料不干扰的情况下，也可选用UV法或原料药项下的容量法 。复方制剂首选HPLC法 。,药品含量测定方法的设计验证,订入质量标准的含量测定法不同于一般质量考察的方法，须经过严格的方法学验证 。容量分析法的验证：精密度：用原料药精制品（含量99.5%）考察方法精密度，平行试验5个样本的RSD0.2%；准确度：以测定原料精制品的回收率计算，应在99.7%100.3%之间（n5,RSD0.1%）；滴定终点确定的依据：包括滴定曲线的绘制，如用指示剂法确定终点，应用电位法校准终点颜色，提供指示剂颜色与电位
12、变化情况的对比结果；,耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明。 HPLC法的验证：精密度：RSD2%（n5）；准确度：用于制剂时，要考察辅料的影响，将一定量药物加到按处方比例配制的辅料中（为标示量的80%120%）制成高、中、低三个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品，按拟定方法测定回收率，应在98%102%之间（n9, RSD2%）。,线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓度的溶液（n57），用浓度C对峰面积A或峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，线性方程的相关系数r0.9990，截距越小
13、越好，并提供线性关系图；专属性：辅料、有关物质或降解产物峰对主药峰应无干扰；耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、流动相组成和pH值、不同品牌或批号的同类色谱柱、柱温、流速、样品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明；灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要求。,UV法的验证：精密度：RSD1%（n5）；准确度：方法同HPLC法，回收率应在98%102%之间（n9, RSD2%），同时要求辅料、有关物质或降解产物在测定波长处无吸收。线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓度的溶液（n57，吸收度A在0.30.7间），用浓度C对A进行回归处理，线性方程的相关系数r应0.9990，截距应趋于零，并提供线性关系图；耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品提取次数、时间、比色法中显色剂用量、反应温度、时间、pH值等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明。,
