膜片钳技术讲座幻灯ppt课件.ppt

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1、,膜片钳技术讲座,2002年11月20日,第一部分 膜片钳技术基本概念第二部分 离子通道基本知识,第一部分膜片钳技术的基本概念,主要内容,1. 膜片钳技术简介2. 膜片钳系统中的电位（电压）与电流3. 膜片钳系统中的电阻4. 膜片钳系统中的电容5. 膜片钳系统中的串联电阻和电容补偿6. 膜片钳系统中的漏减功能7. 膜片钳系统中的信号滤波,1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术（patch clamp techniques）。1980

2、年Sigworth等获得10-100G的高阻封接（Giga-seal），1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，1983年10月，Single-Channel Recording一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。,1. 膜片钳技术简介,内尔(Neher) 萨克曼(Sakmann) （1944-） （1942-） （德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家） 合作发明了膜片箝技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提

3、供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。,膜片钳记录技术创立以来，记录方式的变化 经典记录模式： 贴附式（Cell-attached 或 on cell) 内膜向外式(Inside-out) 外膜向外式(Outside-out) 全细胞记录方式(Whole-cell recording) 发展记录模式： 穿孔膜记录方式（Perforated patches） 穿孔囊泡记录方式（Perforated vesicles） 高阻封接巨膜片记录方式（Gigaseal-Macropatch） 松散封接记录方式 (Loose patch clamp) 细胞内灌流记录方式(Intracellular

4、perfusion patch) 巨大切割膜片钳记录方式（Giant excised patches）,使用的标本 从肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元发展到卵母细胞、内分泌细胞、血细胞、肝细胞等其它多种细胞； 从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到脑片或组织块乃至整体动物。从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到大鼠、人等等。 卵母细胞膜片钳技术、脑片膜片钳技术,脑片膜片钳技术1脑片撕裂法（Slice rending method）,（引自： Stuart et al., 1993）,（引自：Ascher P, 1989）,（引自：The Axon Guide，1993。有改动）,2

5、表面清洁法（Surface cleaning 法）,3. 红外微分干涉相差显微镜法（IR-DIC法 ）,4.盲法（Blind 法）,2. 膜片钳系统中的电位（电压）与电流 钳制电位（Holding potential, Vh） 人为地将细胞膜内外电压差固定在某一数值，这一数值即为钳制电压或钳位电压。实施这一行为的技术为电压钳技术（Voltage clamp）。 命令电压（Command voltage, Vcmp） 通过放大器或计算机发出的电压指令，用于钳制细胞膜电位。,电极电压降（Pipette voltage drop，Vp） 由于有电极电阻（Rp）的存在，命令电压通过时就会产生电压降：V

6、p =I Rp， 因此细胞接受的钳位电压为Vh=Vcmp-Vp。误差产生。 而信号电压在被摄取时也会经过电极电阻，同样会产生电压降，产生误差。 补偿方法：串联电阻的补偿。,液界（接）电位（Liquid junction potential） 主要成分：1. 液体-金属：Pt电极、AgCl电极与电极内液，又称电极电位；2. 电极内液-细胞外液；3. 电极内液-细胞内液（细胞较小、电极开口较大时，此值较小，破膜后，等待一定时间即可消除）。 范围：可达几百mV。补偿方法：“Track”，“Offset”。,浴液电位（Bath potential, Vb） 一般情况下，浴液通过参比电极接入工作地，所有

7、测量的电信号均为相对于此工作地的电位或电流。为真实地反映测量信号V，理论上要求Vb为0 。 V=Vtotal-Vb， Vb =I Rb， V为测量信号，I为钳制电流。 Vb的存在主要是因为浴液电阻Rb的存在。减小Rb就可降低Vb 。要减小Rb就必须知道Rb的来源。,Rb大体上有三个来源： 1. 细胞膜表面与参比电极之间的浴液通路电阻 Ra=/4r(mm)，r为细胞半径。一般为几百。 2. 琼脂盐桥电阻 Ragar=L(cm)/S(cm2)，浴液与KCl液。 长1cm，直径2mm的盐桥， Ragar =130(KCl液), Ragar =2600(Ringer液) 3. 参比电极电阻 与接触面积

8、有关（越大越好），一般上 k。 总电阻大于1k。,在下列情况下，浴液电阻Rb会发生变化，导致记录的信号出现偏差： 1. 浴液中Cl-浓度发生大的变化；（AgCl直流漂移） 2. 浴液温度浓度发生大的变化；（） 3. 钳制大细胞如卵母细胞时（钳制电流较大）。减小Rb的方法： 1. 去除琼脂/KCl盐桥 盐桥的优点：解决AgCl直流漂移，防止Ag、Pt进入浴液； 盐桥的缺点：盐桥电阻，KCl扩散 2. 增大参比电极与浴液的接触面积其它控制Vb的方法：钳制、去除,电极（Electrode） 最常用的是Ag/AgCl电极和Pt电极。1. Ag/AgCl电极Ag + Cl- AgCl + e- （记录电

9、极接受电子）特点： 可逆性； 消耗性； 适用于浴液中含有Cl-的情况； 使用不当时，Ag+可进入浴液影响蛋白活性。,2. Pt电极 2H2O + 2e- 2OH- + H2 2H2O - 2e- 4H+ + O2特点： 不可逆性（不同电流方向化学反应不同）； 不消耗性； 液体与Pt之间的液界电位较大； 可导致局部pH发生变化。,3. Electrode与pipette的区别Electrode 指Ag/AgCl电极和Pt电极，在膜片钳技术中，由于记录电极外被玻璃管，而参比电极（浴液电极）是裸露的，因此常指参比电极。Pipette 指膜片钳电极，为拉制出的玻璃管，它不是真正意义上的电极，而是真正电

10、极的依托。Microelectrode 指细胞外记录电极。Micropipette 指细胞内记录电极（包括全细胞记录电极）。,离子通道电流（Ion channel current） 指离子通道开启时离子跨膜流动产生的电流。离子流动方向取决于细胞膜内外离子浓度差和电学梯度。通道型受体通道开放时为受体电流，全细胞记录时为全细胞电流，单通道记录时为单通道电导（Conductance），单位是西门子（S）,常用pS，符号为G。 Na-K泵产生的电流为泵电流，Na-Ca交换体电流为交换电流。,输入漏电流（Input leakage current） 理论上讲，不施加外部命令时，通过放大器探头的电流应该为

11、0，如果由于放大器本身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于放大器的控制电流漂移的质量很高，一般漏电流都很小，几个pA。 漏（减）电流（Leak current） 细胞膜的被动反应电流，为线性电流。 封接电流（Seal current） 由于封接质量不高（没有形成良好的高阻封接），从封接处产生的电流。成为噪声。,内向电流（Inward current） 从细胞外进入细胞内的正离子（如Na+）电流或从细胞内流向细胞外的负离子（如Cl-）电流。 外向电流（Outward current） 从细胞内流向细胞外的正离子（如K+）电流或从细胞外流向细胞内的负离子（如Cl-）电流。,3. 膜片钳系统中的电阻

12、,膜电阻（Membrane resistance, Rm） 指脂质双分子层的跨膜电阻，反映离子是否容易穿透细胞膜。在细胞膜离子通道关闭时， Rm很大，可达几百M。不同于膜电容， 各种细胞的Rm变异较大。 膜输入阻抗（Membrane input resistance, Rin） 对Rm的测量是通过对膜输入阻抗的测量间接得到的。给细胞膜施加一系列刺激方波，测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin 。注意要在形成全细胞记录时测定，在形成高阻封接时， Rin =Rseal。,封接电阻（Seal resistance, Rseal） 形成高阻封接时的电极电阻。高阻封接叫做“Gigaseal”，为1G及

13、以上的电阻，如果封接不良，则会产生封接电流。1K=1,000, 1M=1,000K, 1G=1,000M. 1G=109. 电极电阻（Pipette resistance, Rp） 电极由两部分组成，即圆桶形的杆部和圆锥形的尖端部。总的电极电阻可用下式表示：为电极内液的电阻率，l为杆部长度；rs为圆锥形的起始半径（m）；rt为电极尖端半径（m）；为电极尖端圆锥形的角度。,串联电阻（Series resistance, Rs）和 通路电阻（接触电阻）（Access resistance, Ra） Ra是指有效电信号整个电路上的电阻。 Rs是指流过电极尖端的电流所遇到的任何电阻。当将电极放入浴液中

14、或在形成高阻封接时， Rs主要是电极电阻；全细胞记录模式形成后， Rs包括电极电阻Rp 、破裂膜的残余膜片电阻、细胞内部电阻。后两者统称为通路电阻Ra ，破裂膜的残余膜片电阻占Ra的主要成分。由于这些电阻在电学上是串联在一起的，故称串联电阻。 Rs和Ra有时也互相通用。,漏电阻（Leak risistance, RL） 又叫被动反应电阻（Passive resistance），亦即 稳态电阻（Steady-state resistance）。是指细胞膜在某一钳制电位下离子通道恒定开启时细胞膜的阻抗。在不同的钳位电压下， RL是不同的。计算公式为： RL = V/kI = W/kD W是钳位电压

15、与初始电压差，D为上述情况的电流差。k为转换因子。,4. 膜片钳系统中的电容,膜电容（Membrane capacitance, Cm） 细胞膜的脂质双分子层是电的不良导体，因而由细胞外液-脂质双分子层-细胞内液就构成了细胞膜电容。Cm的大小与细胞膜表面积（包括内陷折叠部分）成正比，与脂质双分子层的厚度成反比。对于一个球形细胞，膜电容的计算公式为： Cm=d2 / 100 (pF)d为细胞直径（m）。实际上由于有细胞膜内折（Infolding）的存在，Cm要比这大1.5-3倍。一般情况下，生物膜的电容大体都是1F/cm2。,跨壁电容（Transmural capacitance, Ct） 电极

16、浸液部分的内外液之间形成的电容，跨壁电容的介质为玻璃电极壁，因此，其为对细胞外液（浴液）电容。在膜片钳实验中其值可能很大，一般电极浸液深1mm会产生1pF或更大一些的电容。减小跨壁电容的方法： 1. 加厚电极管壁：采用厚壁玻璃毛坯拉制电极，或在电极浸液部分外部涂以硅胶树脂（Sylgard）等疏水性物质。 2. 减小电极浸液深度：浸液部分越大，Ct越大。 3. 补偿电路：即使采取了以上机械物理上的措施，仍会有残余的跨壁电容存在。因此可进一步采用膜片钳放大器内设的电容补偿电路进行补偿。,漂浮电容（Stray capacitance, Cs） 电极非浸液部分与邻近地表之间形成的电容以及电极夹持器、探

17、头导线与邻近地表之间形成的电容等。又称寄生电容或杂散电容，为对地电容。Ca为缓冲运算放大器的输入端与大地及其自身电源、机壳之间的输入电容。,电极电容（Pipette capacitance, Cp） 电极电容包括跨壁电容（ Ct ）、电极非浸液部分与邻近地表形成的漂浮电容（Cs）。在电压钳实验中，对电极电容进行补偿有几个目的：1. “美容”效果：电极电容的充放电电流搀杂在离子通道电流中；2. 电极尖端的电压由于电极电容的充电而变化缓慢，快速激活的离子通道电流因而受到歪曲；3. 如果电极电容没有进行正确补偿，将不能区分电极电容的充电电流与膜电容的充电电流，导致膜电容被过高估计。,慢电容（Slow

18、 capacitance, Cslow）与 快电容（Fast capacitance, Cfast）,高阻封接形成后，快电容主要为电极电容，慢电容为膜片电容，后者数值较小。因此此时要补偿的电容主要为电极电容。 打破细胞膜形成全细胞记录模式后，主要补偿的是慢电容，即细胞膜电容。,输入电容（Input capacitance, Cin） 是膜片钳系统中的分布电容，在膜片钳实验中会给有效信号的记录造成影响，因此必须予以去除。主要包括：1. 跨壁电容Ct；2. 电极非浸液部与邻近地表之间形成的漂浮电容Cs；3. 电极夹持器、探头线与地表间形成的漂浮电容Cs；4. 放大器输入端与大地、自身电源、机壳间的

19、输入电容Ca。 Cin共约几个到十几个pF。,时间常数（Time constant, ） 是指电容充放电变化了原来的63%时所需要的时间。膜反应的时间常数RsCm当Rs=10 M，Cm=33 pF时，膜反应的时间常数=330s，破膜形成全细胞记录模式后，通路电阻Ra一般比电极电阻大两倍，充放电时间更长。,膜电容充电时，跨膜电流 Im由Icharge和IRm组成，Icharge为膜电容瞬变值，IRm很快达到稳定，成为稳态成分。 膜电容放电时，跨膜电流 Im为Idischarge，此时没有稳态成分电流。显然，Icharge = Idischarge。,膜电容充放电时跨膜电流变化曲线,一、串联电阻补

20、偿Rs引起的误差有如下三方面 1. 膜电位对步阶命令电压的反应时间延迟; 2. 串联电阻产生电压降，严重影响膜钳制电位的数值; 3. 串联电阻与膜电容形成了一个单极RC滤波器，限制了摄取电流信号的带宽.,5. 膜片钳系统中的串联电阻和电容补偿,串联电阻补偿的目的1. 加速膜电位对步阶命令电压的反应时间 膜反应时间常数RsCm。 补偿后， RsCm(1% PREDICTION/100)。 若 Rs=10 M，Cm=5 pF， % PREDICTION分别为0、50、90时， 则分别为50s、 25s、5s。 膜电位Vm为： 可见补偿后，明显加快了膜电位对命令电压的反应时间。,2. 去除串联电阻产

21、生的电压降 电极电压降Vp=RsIm，Im为膜离子通道电流。 如果Im=2nA，Rs=10 M， 则Vp=20 mV，表明膜电位将偏离钳位电压20 mV。 CORRECTION电路3. 消除RsCm滤波器对摄取信号带宽的限制 单极RC滤波器对电流幅度无影响，但滤波器的角频率（-3dB）f1/2RsCm。当Rs=10 M，Cm=33 pF时，f483Hz，即此滤波器将信号的带宽限制为480Hz。串联电阻补偿达90%时，信号带宽由原来的f1/2RsCm320Hz增加为f1/2(Rs/10)Cm3200Hz3.2KHz。,二、电极电容及膜电容补偿 1. Axopatch放大器（Axopatch 1和

22、200系列）提供两对儿对电极电容进行补偿的控制钮： Fast magnitude和Fast time constant（）钮 Slow magnitude和Slow time constant（）钮 “Fast”钮补偿快电容，即放大器输入电容，其中以电极电容为主； “Slow”钮补偿慢电容，即电极尖端与大地之间的电容，主要是膜片电容。大部分的电容瞬变值可用“Fast”控制钮进行补偿。提供WHOLE-CELL CAP钮用于补偿膜电容。,Axopatch 200B Fast magnitude , Fast time constant（） 钮 Slow magnitude , Slow time

23、constant（）钮 WHOLE-CELL CAP钮,GeneClamp 500B Fast magnitude , Fast time constant（） 钮 Slow magnitude , Slow time constant（）钮,2.Axopatch放大器（Multiclamp 700A）所有控制钮均由计算机程序“MultiClamp Commander”所控制，其对电极电容和膜电容的补偿可自动进行，并能自动显示补偿的数值。,4. EPC-9放大器同样提供了快电容与慢电容补偿功能： C-Fast功能钮用于补偿快电容，即补偿电极电容和其它漂浮电容。也包括电流幅度与时间常数值两个补偿

24、功能，其范围分别为0-10pF、0.5-8s。 C-Slow功能钮用于补偿慢电容，即细胞膜电容。 EPC-9还提供对快慢电容的自动补偿功能。,漏电流（Leak current） 当膜内外电压差发生变化时，膜电阻会有电流通过，膜电容会有充放电反应，即为电阻电流和电容电流。它们都是非通道电流，这种电流的I-V曲线呈直线。为准确反映电压门控性离子通道电流，就需要消除漏电流。,6.膜片钳系统中的漏减功能,漏减的意义,线性被动反应电流,非线性电压门控性电流,电阻电流和电容电流,离子通道电流,Clamp采入的细胞电流,有整流,无整流,电压门控性离子通道电流,漏电流,V=IRc,V=IRv,漏电流的表现,几

25、种漏减功能（Axopatch系统）1. 放大器漏减功能 (Leak subtraction of amplifier)2. P/N漏减功能 (P/N leak subtraction) 3. 定标P/N漏减功能 (Scaled P/N leak subtraction)4. Clampfit漏减功能 (Leak subtraction of Clampfit),放大器漏减功能（ Leak subtraction of amplifier）,封接后,破膜后,膜电容补偿后,漏减后,P/N漏减功能（ P/N leak subtraction ）,20ms,4nA,-100mV,-60mV,+40mV

26、,P/N漏减前,P/N漏减后,定标P/N漏减功能（Scaled P/N leak subtraction）,漏电流,漏减前,P/N漏减后,定标P/N漏减后,漏减不当的表现,刺激结束时出现Na电流,出现反向Na电流,滤波的目的 通过选择性去除某些信号频率而使信号中的噪声变小，使信号变得清晰、易于分辨。膜片钳技术中最常用的是低通滤波。 -3dB频率（f-3dB） 信号带宽的角频率。在这个频率上，滤波器的输出电压衰减为原信号电压的1/2（0.7071）。,7. 膜片钳系统中的信号滤波,滤波器的种类 低通滤波（Low-pass filter）:适用于膜片钳单通道与全细胞记录。1-2kHz。 高通滤波（

27、High-pass filter）:又称交流耦合（AC coupling）。适用于细胞内记录突触放电，可降低膜电位的低频振荡所带来的干扰。 带通滤波（Band-pass filter）:为低通与高通滤波的交叉，注意高通频率不能高于低通频率。 带阻滤波（Band-reject filter or Notch filter）:适用于去除交流电干扰。,低通滤波,带阻滤波,带通滤波,高通滤波,低通-3dB 500Hz滤波,滤波前,第二部分离子通道基本知识,主要内容,1. 电压门控性离子通道的动力学2. 配体门控性离子通道的特性3. 自发突触活动分析,1. 电压门控性离子通道的动力学 电流密度（ Cur

28、rent density） 单位细胞膜面积的通道电流大小。在进行全细胞电流记录时，由于细胞直径大小的不同，离子通道数目也不相同，因此为便于不同细胞间的比较，采用电流密度这一概念。由于膜电容的大小与细胞大小成正比（Cm=d2 / 100），故 电流密度 = Im/Cm (pA/pF),静息膜电位（ Resting membrane potential）Nerst方程：Es : 跨膜电位, R : 气体常数, T : 绝对温度, F : 法拉弟常数z s: 离子价, So : 细胞膜外离子浓度 , Si : 细胞膜内离子浓度Goldman-Hodgkin-Katz（GHK）方程：P为相对通透力(R

29、elative Permeability), Pk:PNa:PCl=1:0.04:0.45,阈电位（Threshold potential） 阈下电位（Subthreshold potential） 对于电压门控性钠通道来说，当膜电位去极化到一定数值时，离子通道就会大量开放，引起动作电位产生。此去极化数值即为钠通道的阈电位。一般钠通道的阈电位比细胞膜静息电位的绝对值低10-20 mV。 而钠通道在阈下电位时，仅有少数开放，不足以引起动作电位。,钾和钙通道的阈电位 对于电压门控性钾和钙通道来说，当膜电位去极化到一定数值时，就会有离子通道开放，可记录出通道电流。此去极化数值即为通道的阈电位。,激活

30、（Activation）通常用激活曲线表示，反映通道开启的难易程度。 g/gmax= 1-1+exp(Vm-V1/2)/K-1 gNa=INa/(E-ENa), E为去极化钳制电位，ENa为钠通道的平衡电位。,Vm(mV),g/gmax,失活 通道的失活有两种情况：1. 衰减（Decay）: 指通道在激活因素持续存在条件下的关闭，全细胞电流的衰减反映通道的失活快慢，用衰减的时间常数或10-90%时间来表示。2. 稳态失活（Steady-state inactivation）: 它反映通道失活数目的电压依赖性。一般用失活曲线（Inactivation curve）来表示。,衰减（Decay） 电

31、流的衰减过程可用单指数方程或双指数方程拟合（Fit）： Y = A1exp-(t-k) /+A2或 Y = A2exp-(t-k) /2 + A1 exp-(t-k) /1+C,2,1,稳态失活（Steady-state inactivation） 采用双脉冲方波实验方法。,采用Boltzmann方程对失活曲线进行拟合I / Imax= 1+exp(V-V1/2)/k-1,失活后的恢复 采用双脉冲方波实验方法。,I-V曲线（Current-voltage curve）电流-电压关系曲线。可反映通道的如下动力学参数： 激活过程 阈电位 反转电位 整流特性,整流（Rectification）电流和

32、电压的关系不满足欧姆定律的直线关系。原因是离子通道的开放导致膜电阻发生了变化。,离子通道不开放时膜的被动反应,离子通道开放时膜的主动反应,外向整流随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠近。如IK电流。 内向整流随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠近。如烟碱电流。,IK电流的外向整流,烟碱电流的内向整流,去极化方向,去极化方向,去激活（Deactivation） 指通道在激活因素结束时的关闭过程，所记录到的电流称为尾电流（Tail current）。,5ms,2nA,Vh=-100mV,-40mV,-70mV,尾电流的电压依赖性,尾电流的电压依赖性,电流的Rundown

33、现象 指随着记录时间的延续，通道电流逐渐降低的现象。许多种类的细胞其钙电流都具有Rundown现象。全细胞封接模式形成以后，由于电极充灌液迅速充斥于细胞内，细胞内大分子成分与之形成交换透析，造成稀释或丢失。同时，细胞内ATP也因稀释而严重不足，但钙离子的外排耗能却较大，这是导致Rundown现象发生的直接原因。,减小电流Rundown的方法： 1. 电极内充灌ATP、GTP等可减弱Rundown发生速率。 2. 采用穿孔式膜片钳记录方法（Perforated patch clamp），由于其只在细胞膜上用药物形成微小孔洞而不打破细胞膜，所以细胞内大分子成分和ATP均不会被稀释或丢失，能够有效地

34、抑制Rundown现象的发生。,2. 配体门控性离子通道的动力学 浓度依赖性（Dose-dependent） 电压依赖性（Voltage-dependent） 失敏（Desensitization） 使用依赖性（Use-dependent）,Glu受体电流,GABAA受体电流,3. 自发突触活动分析 微小兴奋性突触后电流 （Miniature excitatory post synaptic current, mEPSC） mEPSC是突触前膜Glu随机量子释放引起的突触后膜反应，其频率的增高一般反映单位时间内Glu随机量子释放的数目增加，它不受TTX的影响。,自发兴奋性突触后电流 （Spon

35、taneous excitatory post synaptic current, sEPSC） sEPSC是突触前膜由自发动作电位诱发的Glu释放而引起的突触后膜反应。sEPSC频率的增高反映单位时间内Glu释放量的增加，包括Glu随机量子释放的数目增加以及自发动作电位诱发的Glu量子释放数目的增加。,mEPSC,sEPSC、mEPSC,自发动作电流（Spontaneous action current, sAC）。 当由突触前膜自发动作电位诱发的Glu量子释放达到较大数量时，突触后膜在产生的sEPSC基础上就引发了sAC。sEPSC和 sAC成分中均有大量钠通道的参与。,自发抑制性突触后电

36、流（Spontaneous inhibitory post synaptic current, sIPSC） 微小抑制性突触后电流（Miniature inhibitory post synaptic current, mIPSC）,附录1. 膜片钳采样软件中的几个术语 Episode 又称Sweep，指每一条描记线（trace），一系列的Episode组成一个Run。可译为“事件”，但注意不同于“event”。 pClamp 7及8中一个Episode最少为12点，最大为103224点，相当于10秒多的时间。 Run 每个Trial中所包含的采集轮数，如大于1，则自动对电流进行平均。可用于单

37、个细胞的I-V曲线制作。 Trial 实验次数，相当于自动连续施行无数次protocol，必须人为按“Esc”键才能停止。不同于Run，因其不能对电流进行平均。,Segment Episode中可包含1-4个Segment，这用于多导通道记录。每一个Segment含512个采样点。Segment仅为5.51和6版中所有。 Epoch Episode中设定的A、B、C、D等各段。pClamp 7及8共有10段，5.51和6只有A-D四段。注意Epoch的点数小于Episode的点数，Episode中还含有H1和H2段。H1=6n（5.51和6版）或8n（7及8版），n分别为512和516的倍数。

38、H2= Episode- Epoch-H1。,Signal pClamp 7及8中指Channel（记录通道） Protocol 采样参数设定模式，可存为文件（*.pro）。 Stimulus Waveform protocol中的刺激参数设定模式。 First clock interval和Second clock interval 一个Episode时程中的前半部分和后半部分，在pClamp 7及8中，采用“gear shift”（轮转）表示，但可任意分配两部分的比例。,Bottom中，一次这样的记录为一个Run，其中每一条线（Trace）为一个Episode，由于是单导（one sign

39、al）记录，故Segment为1。Top为Stimulus Waveform，其中A，B，C段均称为Epoch，在A之前和C之后，各有一定数目的采样点，不属于Epoch，在5.51版，称为H1和H2段）。,附录2. 推荐书目王绍, 徐涛. 电生理学方法. 韩济生主编. 神经科学原理. 第二版. pp55-65. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1999.张均田主编. 现代药理学实验方法. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.陈军. 膜片钳实验技术. 北京: 科学出版社, 2001.刘振伟. 脑片膜片钳技术及其研究概况. 张均田主编. 神经药理学研究进展. pp

40、137-150. 北京：人民卫生出版社，2002.Sakmann B and Neher E. Single-Channel Recording. New York: Plenum Press. 1983.Sherman-Gold R. The Axon Guide. Axon Instruments Inc. 1993.Chad J and Wheal H. Molecular Neurobiology: a practical approach. New York: Oxford University Press, 1991.Hille B. Ionic Channels of Excitable Membrane. Massachusetts: Sinauer Associates Inc.1992.Methods in Enzymology. 1992; 207,