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1、引物设计实例分析,引物设计基本原则,引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值 (melting temperature)G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin）阅读框,1. 引物的长度,一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度,2.产物的长度,扩增片段长度为100600碱基对.,3. Tm值,引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的
2、G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G),4. 引物的GC含量,有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,5. 引物自身,引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败,1.打开软件，调入序列,2、选择路径，选择序列文件名，加入右框,3、序列文件显示如图，点击“primer”；,4. 按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“确定”进行引物搜寻,5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“确定”。,6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况
3、，依次筛选,Primer Premier5的引物评价窗口,任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1,SP,BamHI,pcDNA3.1,NR1,Plasmid 1:,Plasmid 2,GFP,SP,BamHI(GGATCC),pcDNA3.1,NR1-1a,GFP,121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat
4、 tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccac
5、ccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttg
6、gagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa,NR1的编码序列(4000bp),红色为信号肽, 蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出酶切位点的阅读框,ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGC
7、AAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAG
8、TAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAA,
9、GFP序列(700bp),引物要求,PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5,GFP序列,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3,3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5,Primer1: 5ATGGTGAGCAAG
10、GGCGAGGAGC,.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2: 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,第一步：扩增GFP基本序列,变性, 引物复性,第二步：GC比值；Tm值,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC
11、GAGA.,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）,第三步：酶切位点,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）,BamHI: ggatcc,Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,第四步：阅读
12、框,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.,Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGG
13、CGAGGA,NR1序列：,Primer1: 5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctg
14、tcagtgt gtgaggacct,NR1序列：,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3,GFP序列,cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct,插入GFP后的组合序列,Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,Primer2: 5 gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC,第五步 保护序列,Primer1: 5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,
