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1、第五章 序列的同源性比较 及分子系统学和分子进化分析,相似性和同源性关系,序列的相似性和序列的同源性有一定的关系，一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似性来推测序列是否同源。 正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源性为80一说。,序列相似性比较和序列同源性分析,序列相似性比较： 将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、F
2、ASTA等,序列同源性分析： 将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包有CLUSTAL等,Blast程序,BLAST 是一个基于序列相似性的数据库搜索程序。是“局部相似性基本查询工具”(Basic Local Alignment Search Tool)的 缩写。 Blast 是一个序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据查询的对象和数据库的不同来定义的。,Blast程序的选择,Blast 是一个序列相似性搜索的程序包
3、，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据查询的对象和数据库的不同来定义的。,主要的blast程序,Blast资源,主站点：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/(网络版) ftp:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ (单机版),其他站点： http:/ http:/nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html,Blast结果,Blast结果会列出跟查询序列相似性比较高，符合限定要求的序列结果，根据这些结果可以获取以下一些信息。查询序列可能具有某种功能查询序列可能是来源于某个物种查询序列可能是某种功能基因的同源基因,Bl
4、ast的版本,网络版本NCBI在内的很多网站都提供了在线的blast服务，是最经常用到的blast服务。优点：方便，容易操作，数据库同步更新等优点。缺点：不利于操作大批量的数据，同时也不能自己定义搜索的数据库,单机版 通过NCBI的ftp站点获得。获得程序的同时必须获取相应的数据库才能在本地进行blast分析。 优点：可以处理大批的数据，可以自己定义数据库， 缺点：需要耗费本地机的大量资源，此外操作也没有网络版直观、方便，需要一定的计算机操作水平。,Blast程序评价序列相似性的两个数据,Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配
5、片段越长、 相似性越高则Score值越大。E value:在相同长度的情况下，两个氨基酸残基（或碱基）随机排列的序列进行打分，得到上述Score值的概率的大小。E值越小表示随机情况下得到该Score值的可能性越低。,NCBI提供的Blast服务,登陆ncbi的blast主页,核酸序列,蛋白序列,翻译序列,还有其他一些针对特殊数据库的和查看以往的比对结果等,Blast任务提交表单（一）,1.序列信息部分,填入查询（query）的序列,序列范围（默认全部）,选择搜索数据库,如果接受其他参数默认设置，点击开始搜索,Blast任务提交表单（二）,设置搜索的范围，entrez关键词，或者选择特定物种,2
6、.设置各种参数部分,一些过滤选项，包括简单重复序列，人类基因组中的重复序列等,E值上限,窗口大小,如果你对blast的命令行选项熟悉的话，可以在这里加入更多的参数,Blast任务提交表单（三）,3.设置结果输出显示格式,选择需要显示的选项以及显示的文件格式,显示数目,Alignment的显示方式,筛选结果,E值范围,其他一些显示格式参数,点击开始搜索,提交任务,返回查询号（request id）,可以修改显示结果格式,修改完显示格式后点击进入结果界面,结果页面（一）,图形示意结果,结果页面（二）,目标序列描述部分,带有genbank的链接，点击可以进入相应的genbank序列,匹配情况，分值，
7、e值,结果页面（三）,详细的比对上的序列的排列情况,一个具体的例子（blastp）,假设以下为一未知蛋白序列query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVS
8、GKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADST QA 我们通过blast搜索来获取一些这个序列的信息。,具体步骤,1.登陆blast主页http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/2.根据数据类型，选择合适的程序3.填写表单信息4.提交任务5.查看和分析结
9、果,分析过程（一）,1.登陆ncbi的blast主页,2.选择程序，因为查询序列是蛋白序列可以选择blastp，点击进入,也可以选择tblastn,作为演示，我们这里选blastp,分析过程（二）,3.填入序列（copypaste）Fasta格式，或者纯序列,4.选择搜索区域，这里我们要搜索整个序列，不填,5.选择搜索数据库，这里我们选nr(非冗余的蛋白序列库)。,是否搜索保守区域数据库（cdd），蛋白序列搜索才有。我们选上,分析过程（三）,6.限制条件，我们限制在病毒里面找。,7.其他选项保持默认值,打分矩阵,分析过程（四）,8.输出格式选项保持默认值,9.点击开始搜索,分析过程（五）,10
10、.查询序列的一些相关信息,在cdd库里面找到两个保守区域，点击可以进入,分析过程（六）,图形结果,分析过程（七）,匹配序列列表,分析过程（八）,具体匹配情况,其他的序列相似性搜索工具 FastA,FastA算法是由Lipman和Pearson于1985年发表的（Lipman和Pearson，1985）。FastA的基本思路是识别与代查序列相匹配的很短的序列片段，称为k-tuple。以下链接是EBI提供的fasta服务。 http:/www.ebi.ac.uk/fasta,帮助信息,各个参数选项,填入搜索序列,多序列比对及Clustal的使用,多序列比对的意义用于描述一组序列之间的相似性关系，以
11、便了解一个基因家族的基本特征，寻找motif，保守区域等。用于描述一个同源基因之间的亲缘关系的远近，应用到分子进化分析中。,多序列比对的方法,同源性分析中常常要通过多序列比对来找出序列之间的相互关系，和blast的局部匹配搜索不同，多序列比对大多都是采用全局比对的算法。这样对于采用计算机程序的自动多序列比对是一个非常复杂且耗时的过程，特别是序列数目多，且序列长的情况下。,多序列比对的方法,1.手工比对(辅助编辑软件如bioedit，seaview，Genedoc等)通过辅助软件的不同颜色显示不同残基，靠分析者的观察来改变比对的状态。 2.计算机程序自动比对 通过特定的算法（如同步法，渐进法等）
12、，由计算机程序自动搜索最佳的多序列比对状态。,自动多序列比对的算法,1.同步法 将序列两两比对时的二维动态规划矩阵扩展到三维矩阵。即用矩阵的维数来反映比对的序列数目。这种方法的计算量很大，对于计算机系统的资源要求比较高，一般只有在进行少数的较短的序列的比对的时候才会用到这个方法。,2.步进法 最常见的就是clustal所采用的方法。 其基本思想就是基于相似序列通常具有进化相关性的这一假设。,多序列比对工具 clustalw,Clustalw是一个单机版的基于渐进比对的多序列比对工具，由Higgins D.G. 等开发。有应用于多种操作系统平台的版本，包括linux版，DOS版的clustlw，
13、clustalx等。,CLUSTALW是一种渐进的比对方法，先将多个序列两两比对构建距离矩阵，反应序列之间两两关系；然后根据距离矩阵计算产生系统进化指导树，对关系密切的序列进行加权；然后从最紧密的两条序列开始，逐步引入临近的序列并不断重新构建比对，直到所有序列都被加入为止。,Clustalx的工作界面 （多序列比对模式）,Clustalx的工作界面 （剖面(profile)比对模式）,Clustalw的工作原理,Clustalw输入多个序列,快速的序列两两比对，计算序列间的距离，获得一个距离矩阵,邻接法(NJ)构建一个树（引导树）,根据引导树，渐进比对多个序列。,Clustalw的应用,1.输
14、入输出格式。输入序列的格式比较灵活，可以是前面介绍过的FASTA格式，还可以是PIR、SWISS-PROT、GDE、Clustal、GCG/MSF、RSF等格式。输出格式也可以选择，有ALN、GCG、PHYLIP和NEXUS等，用户可以根据自己的需要选择合适的输出格式。,2.两种工作模式。 a.多序列比对模式。 b.剖面(profile)比对模式。,GCG序列对比软件,GCG (Genetics Computer Group)是生物信息界最广为人知的分子序列分析软件包，最早是在美国的威斯康辛大学麦迪逊校区(University of Wisconsin-Madison)内发展起来的，后来独立成
15、为一个商业公司，期间曾经是Oxford Molecular 的分支机构,在2000 年又由Pharmacopeia 所并构。,GCG 软件包包括了超过130个独立的序列分析程序，大致上可以分成以下12个类别： 1. Sequence Comparison 2. Database Searching and Retrieval 3.DNA/RNA Secondary Structure Prediction 4.Editing and Publication 5.Evolutionary Analysis 6.Fragment Assembly 7.Gene Finding and Patter
16、n Recognition 8.Importing and Exporting 9.Mapping 10.Primer Selection 11.Protein Analysis 12.Translation,除了分析程序以外， GCG 同时也提供多种生物学数据库。核酸相关的:GenBank(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) EMBL (http:/www.ebi.ac.uk/) 蛋白质相关的： SWISS-PROT (http:/www.expasy.ch/sprot/) PIR (http:/www-nbrf.georgetown.edu/pir/) SP-TrE
17、MBL (http:/www.expasy.ch/sprot/ ) 使用者可以输入自己实验获得的分子序列， 或者从这些数据库中来获取得到分子序列，再用到GCG的分析程序进行分析。,执行GCG程序的方法,1.传统的命令行形式，这种情况要求用户熟悉程序的命令。2.借助SeqLab的用户窗口界面，通过各类表单的操作来实现分析任务。以上两个执行GCG的方法都是通过telnet来实现的。3. 借助于WWW服务的SeqWeb，是最为简单和方便的使用方式。 虽然命令行的操作需要一些操作，但是对于熟悉GCG的用户来说，却是最为快捷和有效的方法，此外这种方法还可以扩展到批处理中。,分子进化分析与相关分析软件的应
18、用,分子进化分析介绍,研究目的 从物种的一些分子特性出发，从而了解物种之间的生物系统发生的关系。 通过序列同源性的比较进而了解基因的进化以及生物系统发生的内在规律,系统发育树,是对一组实际对象的世系关系的描述（如基因，物种等）,分子进化研究的基础,核苷酸和氨基酸序列中含有生物进化历史的全部信息在各种不同的发育谱系及足够大的进化时间尺度中，许多序列的进化速率几乎是恒定不变的。（分子钟理论， 1965 ）虽然很多时候仍然存在争议，但是分子进化确实能阐述一些生物系统发生的内在规律。,系统发育树重建的基本方法,最大简约法(maximum parsimony,MP)距离法(distance)最大似然法(
19、maximum likelihood,ML),最大简约法,最大简约法(maximum parsimony,MP)最早源于形态性状研究，现在已经推广到分子序列的进化分析中。最大简约法的理论基础是奥卡姆（Ockham）哲学原则，这个原则认为：解释一个过程的最好理论是所需假设数目最少的那一个。对所有可能的拓扑结构进行计算，并计算出所需替代数最小的那个拓扑结构，作为最优树。,优点：,最大简约法不需要在处理核苷酸或者氨基酸替代的时候引入假设（替代模型）。此外，最大简约法对于分析某些特殊的分子数据如插入、缺失等序列有用。,缺点：在分析的序列位点上没有回复突变或平行突变，且被检验的序列位点数很大的时候，最大
20、简约法能够推导获得一个很好的进化树。然而在分析序列上存在较多的回复突变或平行突变，而被检验的序列位点数又比较少的时候，最大简约法可能会给出一个不合理的或者错误的进化树推导结果。,距离法,距离法又称距离矩阵法，首先通过各个物种之间的比较，根据一定的假设（进化距离模型）推导得出分类群之间的进化距离，构建一个进化距离矩阵。进化树的构建则是基于这个矩阵中的进化距离关系,Fitch-Margoliash Method（FM法）Unweighted Pair Group Method (UPGMA法),Fitch-Margoliash方法（FM法）,1.找出关系最近的序列对，如A和B2.将剩余的序列作为一
21、个简单复合序列，分别计算A、B到所有其他序列的距离的平均值3.用这些值来计算A和B间的距离4.将A、B作为一个单一的复合序列AB，计算与每一个其他序列的距离，生成新的距离矩阵5.确定下一对关系最近的序列，重复前面的步聚计算枝长6.从每个序列对开始，重复整个过程7.对每个树计算每对序列间的预测距离，发现与原始数据最符合的树,最大似然法（ML）,最大似然法(maximum likelihood,ML)最早应用于系统发育分析是在对基因频率数据的分析上，后来基于分子序列的分析中也已经引入了最大似然法的分析方法。,最大似然法分析中，选取一个特定的替代模型来分析给定的一组序列数据，使得获得的每一个拓扑结构
22、的似然率都为最大值，然后再挑出其中似然率最大的拓扑结构作为最优树。在最大似然法的分析中，所考虑的参数并不是拓扑结构而是每个拓扑结构的枝长，并对似然率球最大值来估计枝长 。,最大似然法的建树过程是个很费时的过程，因为在分析过程中有很大的计算量，每个步骤都要考虑内部节点的所有可能性。 最大似然法是一个比较成熟的参数估计的统计学方法，具有很好的统计学理论基础，在当样本量很大的时候，似然法可以获得参数统计的最小方差。只要使用了一个合理的、正确的替代模型，最大似然法可以推导出一个很好的进化树结果。,常见的分子进化分析程序,1.Phylip 由华盛顿大学遗传学系开发，是一个免费的系统发育分析软件包，可以通
23、过以下地址下载。http:/evolution.genetics.washington.edu/phylip.html2. PAUP 最早是在苹果机上开发的具有菜单界面的进化分析软件，早先版本只有MP法，后续版本已经包括距离法和ML法，现今有mac，win，linux等多种版本，该软件不是免费软件，使用者需要向开发者购买。3.PAML 是免费软件包，以下链接可以下载软件和说明书http:/abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html,Phylip软件包介绍,Phylip是一个免费的系统发生(phylogenetics)分析软件包,以由华盛顿大学遗传学系开发.
24、下链接可以下载：http:/evolution.genetics,washington.edu/phylip.html,Phylip包含了35个独立的程序，这些独立的程序都实现特定的功能，这些程序基本上包括了系统发生分析的所有方面。 Phylip有多种不同平台的版本（包括windows，DOS，Linux，Unix等。,Phylip是目前最广泛使用的系统发生分析程序，主要包括一下几个程序组：分子序列组，距离矩阵组，基因频率组，离散字符组，进化树绘制组。,Phylip软件包分组介绍,分子序列组： 1.蛋白质序列：protpars，proml，promlk， protdist 2.核酸序列：dna
25、penny，dnapars， dnamove，dnaml，dnamlk， dnainvar，dnadist，dnacomp,距离矩阵组：Fitch，kitsch，neighbor基因频率组：Gendist，contml离散字符组：Pars，mix，move，penny，dollop，dolmove，dolpenny，clique，factor进化树绘制组：drawtree，drawgram,Phylip软件包的应用,1，根据你的分析数据，选择适当的程序 如，你分析的是DNA数据，就在核酸序列分析类中选择程序（dnapenny，dnapars，dnamove，dnaml，dnamlk,dnain
26、var，dnadist，dnacomp ）如果分析的是离散数据，如突变位点数据，就在离散字符组里面选择程序。,2.选择适当的分析方法如你分析的是DNA数据，可以选择简约法（DNAPARS），似然法（DNAML， DNAMLK），距离法等（DNADIST）3.进行分析 选择好程序后，执行，读入分析数据，选择适当的参数，进行分析，结果自动保存为outfile，outtree。,Outfile是一个记录文件，记录了分析的过程和结果，可以直接用文本编辑器（如写字板）打开。Outtree是分析结果的树文件，可以用phylip提供的绘树程序打开查看，也可以用其他的程序来打开，如treeview。,PAUP
27、,PAUP是最著名的系统发育分析商业软件。程序与平台无关。PAUP使用一种称为NEXUS的数据格式。 PAUP对系统进化树进行重新排布时更加广泛，对支长迭代的收敛标准更加严格，因此，所找到的系统进化树同PHYLIP的一样好，或更好。,PAUP的数据格式(Nexus),主要包括taxa，characters，assumptions，sets，trees，codons，distances，paup八个数据块。 对于一个常规的分析，taxa，characters块是必须的。而分析的命令可以通过菜单操作（mac），或者键盘命令(win,linux)，也可以在nexus文件中加入paup命令块,PAUP
28、的Nexus的文件块,1.TAXA块 主要是定义所分析的数据（如分子序列）个数，以及这些数据的名称（如物种名称）。2. CHARACTERS 块 主要是定义数据矩阵（如多序列比对结果）和其他一些相关的信息（如序列特征值，序列有效区域等）,3. ASSUMPTIONS块 定义了对数据的一些设定，如那些特征值是不需考虑的，怎么处理gap这个特征值等，用户自定义的一些数据也放在这块，如自定义的打分矩阵。4. SETS块 定义了一系列的数据组，如特征值组，物种组等，这些设置都是为了方便后续的分析。,5. TREES 块 定义了用户自己设定的树。用于后续的分析，如作为限制树等。6. CODONS 块 定
29、义了遗传密码子的一些信息。如编码的位置（哪些是编码的，密码子的位点等）。7. DISTANCES 块 定义了一些距离矩阵,8. PAUP 块是软件的核心块，所有的分析命令和一些参数设置（90多个命令）都放在这一块。这一块并不是分析输入数据所必须的，这些命令可以写在这一块（文件中），这时载入文件时就开始根据该块的命令进行分析（有点类似dos的批处理过程）。当然也可以通过键盘命令逐一敲入 ，交互进行分析。 批处理的方式在分析过程比较长，耗时比较久的时候是比较有用的。当然在进行处理之前一定要先保证该批处理过程没有问题,一些要注意的问题,1）系统发育分析中，最重要的因素不是对系统发育程序所采用的方法，而是输入数据的质量。2）应从尽可能多的角度观察数据3）选择合适的外群对 分析相当重要4）仅仅是因为序列输入顺序不同，程序也会给出不同的系统树,其他分子标记在生物系统学中的应用1）RFLP（restriction fragment length polymorphism)标记2）PCR扩增片段长度的多样性3）SNP标记4）同工酶,
