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1、HIV-1耐药及耐药检测,中国医科大学附属第一医院艾滋病研究所张 旻,HIV病毒模式图,HIV病毒颗粒由基因组RNA、外膜蛋白Env、衣壳蛋白Gag、逆转录酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN组成,HIV生活周期,吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放,HIV基因组模式图,我国及国际两种不同抗HIV治疗方案效果比较,注：上标字母相同表示组间无显著差异，上标字母不同表示组间差异显著,项目周期:五年,2005年7月-2010年6月。第一期两年，2005年7月-2007年6月全球基金将根据第一期执行情况确定后三年的投入。项目实施地区：广西、贵州、湖南、江西、四川、新疆、云南个省（自治区） ，35个地(州、市
2、），76个项目县（市、区）。,总经费预算：五年总经费为9807万美元,其中全球基金支持约6374万美元,中国政府配套约3433万美元.配套比例逐年增加，由第一年的20%，增加到第五年的50%。两年经费预算：二年预算约为3100万美元,其中全球基金支持约2400万美元,中国政府配套约700万美元. 。,目标六：建立服务网络，确保针对艾滋病病人/感染者开展的治疗、关怀和支持等活动的开展，包括母婴阻断。活动：在项目省建立和运转耐药监测实验室,开展耐药监测工作,帮助扩展和改进国家耐药监测网络各省省级建立实验室定为哨点的项目县按方案采集血样,需要了解的主题:,什么是耐药性? 药物的作用靶点与机制? 与病
3、毒的哪些基因有关? 耐药性是怎么产生的? 那些因素促使耐药性病毒株出现? 耐药性分类与耐药机制。 如何检测耐药株? 检测中注意事项。,什么是HIV耐药性?,HIV耐药性是指病毒通过自身的遗传变异，产生对药物抑制作用，使药物敏感性降低或不敏感的现象。,什么是HIV耐药性?,IC50 = 50% 抑制浓度,药物的作用靶点与机制?,药物的作用靶点与机制：,Antiretroviral Drugs 2004,NRTIs NNRTIs PIsZidovudineNevirapine*SaquinavirDidanosine DelavirdineRitonavirStavudineEfavirenz*I
4、ndinavirLamivudine*Nelfinavir*ZalcitabineAmprenavirAbacavirLopinavir/r CombivirAtazanavirTrizivirFosamprenavirDidanosine ECStavudine SRFTC,Nucleotide RTI TenofovirEntry Inhibitors T20,药物的作用靶点与机制：,耐药性是怎么产生的?,病毒自身因素 内因 药物的选择压力 外因,耐药性是怎么产生的?,病毒自身因素 内因 HIV-l的逆转录酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能， 因此，在复制过程中，病毒核酸表现出高度的错
5、误倾向性。 在病毒的高速复制过程中，高频率突变在很短的时间内随 时发生。 每个复制周期产生一个突变点； 每天产生109 1010 个新病毒； 病毒基因组中平均每个碱基每天突变一次,耐药性是怎么产生的?,药物的选择压力 外因 在药物选择压力下，耐药变异株完全取代药物敏感株最快 能发生在14 至28天内。,“Wild” type virus(drug susceptible),“Mutant” virus(drug resistant),Drug Pressure,TIME,Viral Dynamics and Drug Resistance,Viral Load &Replication Rat
6、e,Viral Load &Replication Rate,TIME,Low Replication Rate&Viral LoadLess “fit” virus,Pressure: Drug A,Pressure: Drug B,Pressure: Drug C,.,(Combined) Use of Active Antiretroviral Agents,耐药性是怎么产生的?, 耐药株是在病毒自发性的、高频率的基因突变中产 生，在药物选择性的压力下优势复制的结果。,那些因素促使耐药性病毒株出现?,1.,那些因素促使耐药性病毒株出现?,病毒学失败率 (%),0,20,40,60,80,
7、100,95,90-95,80-90,70-80,70,服药依从性 (%),82.1,71.4,66.7,54.6,21.7,2.,那些因素促使耐药性病毒株出现?,服药依从性 (%),2.,那些因素促使耐药性病毒株出现?,药物配伍不当 药代显著不同药物配伍,3.,那些因素促使耐药性病毒株出现?, 细胞周期依赖性药物AZT, D4T ( 活化期细胞)DDI (静止相细胞)蛋白酶抑制剂 (活化期细胞) 非细胞周期依赖性药物3TC, FTC, AbacavirTenofovirNNRTIs,3. 药物配伍不当 缺乏对某一时相细胞内病毒抑制或抑制不足,那些因素促使耐药性病毒株出现?, 胃肠道吸收不好：
8、呕吐，腹泻； 随意间歇服药； 与中药或其他药物同时服用。,4. 其他因素,什么是好治疗方案?, 能快速抑制病毒； 不易产生耐药性； 可长期维持；,耐药性分类,1、原发性耐药(Primary resistance): 病人在接受抗病毒治疗前产生了药物作用靶点的变异，或者感染了耐药毒株，均降低抗病毒药物的敏感性。在已经开展HAART的国家普遍存在，感染了耐药毒株的病人很容易引起药物治疗失败。2、继发性耐药(Secondary resistance): 病人已经接受了抗病毒治疗并产生治疗失败，在药物的选择压力下产生的耐药。,耐药机制：,核苷和核苷类似物1、破坏核苷类似物结合病毒DNA的能力 M184
9、V 突变: RT酶第184位密码子 的氨基酸由蛋氨酸(M)变成为缬氨酸(V) 。拉米夫定(Lamivudine) Q151M mutation: 在HIV-1中出现低于 5%；HIV-2中出现频率较高。,耐药机制：,2、切除病毒DNA链末端的核苷类似物Thymidine analogues mutations: 突变引起ATP或者焦磷酸介导的切除DNA链3末端核苷类似物。,核苷和核苷类似物,耐药机制：,非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI) 突变降低了抑制剂对酶的结合力。不同于核苷逆转录酶抑制剂，其单一突变就能导致高度耐药。如K103N、Y181C。,耐药机制：,K103N突变的机制,耐药机制：,
10、蛋白酶抑制剂,突变点的表示方法：,基因的突变通常以字母数字字母的书写方式来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸，中间数字表示突变点的位置。例如：逆转录酶（RT）K103N的突变表示逆转录酶第103位密码子的氨基酸由天冬酰胺（K）变成为赖氨酸（N）。,如何检测耐药株：,目前耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低，技术也相对容易，可在样品收集后12周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与
11、抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。,如何检测耐药株：,基因型和表型检测,检测中注意事项:, 在病人仍在治疗失败的方案上收集样品，可保 证耐药株占总病毒量的20%以上； 病毒载量 1000时, 可出现假阴性。,我国HIV耐药性本底抽样调查结果,1)对于RT基因区共完成对21个省区共143个样本的测序，仅有2例发现具有轻微耐药（占总样本数的1.4%） 2)对于蛋白酶基因区本次调查共完成20个省区168个样本的分析，仅发现有2例样本（占总样本数1.21
12、%）具有轻微耐药。 结论：当前我国HIV耐药性处于较低状态，对于几乎所有药物敏感，我国抗HIV药物的使用如果有计划的开展，应当会有较好的效果，但应加强治疗依从性促进工作和耐药毒株的监测工作。,HIV基因型耐药性检测（序列测定法）,检 测 流 程,病人血浆标本,HIV RNA,病毒 cDNA,HIV RT和PR基因片段,序列测定,结果解释,RNA提取,逆转录,PCR扩增,特定的解释系统,标本新鲜EDTA抗凝血浆，或-80保存，避免反复冻融,病毒RNA提取（ Qiagen公司试剂盒）,裂解标本，灭活RNA酶,加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合,洗两次，去除杂质,用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA,收集R
13、NA备用,优点：操作简便、快速、得率高,逆转录 RNA cDNA,反应体系： 10XBuffer 1l dNTP 0.5l 外侧反向引物 1l RNase inhibitor 0.25l M-MuLV RT 0.25l DEPC水 2l RNA模板 5l42水浴1小时，95 5分钟灭活RT,巢式PCR扩增病毒蛋白酶和逆转录酶基因,第一轮扩增反应体系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 外侧正向引物 1l 外侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l cDNA模板 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环,巢式PCR扩增
14、病毒蛋白酶和逆转录酶基因,第二轮扩增反应体系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 内侧正向引物 1l 内侧反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l 第一轮扩增产物 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循环,扩增产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳,扩增产物纯化QIAquick Gel extraction试剂盒核酸序列测定双脱氧链末端终止法,:Protease:CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGA
15、TGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAGGACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTTRT:AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGA
16、AAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGATGTGGGTGATGCATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGC
17、ATTTACCATACCTAGTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA,利用网络
18、工具确定耐药性突变并进行耐药性解释,Web站点：http:/hivdb.stanford.edu,HIV Drug Resistance Algorithm2,HIV Drug Resistance Algorithm3,HIV Drug resistance database,HIV Drug Resistance Algorithm1,高度耐药：大于60分中度耐药：3059分低度耐药：1529分潜在低度耐药：1014分敏感：09分,耐药性突变计分,HIV-1耐药性检测的临床指征：（1）抗病毒治疗病毒学失败需要改变抗病毒治疗方案时应进行耐药性检测以协助选择有效的抗病毒药物。（2）抗病毒治疗病
19、毒载量下降不理想时可进行HIV-1的耐药性检测。（3）抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应该在病人仍在服药时或停药后立即（4周内）进行检测。,HIV-1耐药性检测的临床指征：（4）急性HIV1感染的病人进行抗病毒治疗，最好进行耐药性检测，对于选择合适的抗病毒药物、取得最佳抗病毒效果很有益处。（5）对于未经抗病毒治疗的慢性HIV感染者不一定要做耐药性检测，但当有迹象显示感染的是耐药性HIV毒株时（例如感染来自于正在服用抗病毒药物的病人），就应当进行耐药性检测。（6）不推荐对病毒载量1000cp/ml的病人做病毒载量检测，因为病毒水平太低很难扩增出目的基因片段,耐药性检测结果的解释HIV-1的耐
20、药性不是全或无的现象，基因型和表型耐药性检测结果的分析和解释都有困难所有抗病毒治疗都是联合用药，他们之间是相互协同的，即对一种药物的敏感性降低并不干扰同一治疗方案中其他药物的抗病毒活性。药物即使有耐药性也可能有益处，因为有耐药性突变的病毒比敏感毒株的复制适应性要差得多。血清中药物的水平，特别是蛋白酶类药物是高度变化的，如果能够提高血清中蛋白酶类药物的浓度，低水平的蛋白酶耐药性有时能够被克服。,Nucleoside Resistance Mutations,Zidovudine41, 67, 70, 210, 215, 219 (TAMs)Didanosine65, 74, 75, 184Zal
21、citabine65, 69, 74, 184Stavudine41, 67, 70, 75, 210, 215, 219(TAMs)Lamivudine184Abacavir41, 65, 67, 70, 74, 115, 184, 210, 215, 219Multinucleoside ResistanceMultiple TAMs41, 67, 70, 210, 215, 219 69 insertion complex 41, 62, 67, 69, 70, 210, 215, 219151 complex 62, 75, 77, 116, 151,NNRTI Resistance
22、Mutations,Nevirapine100, 103, 106, 108, 181, 188, 190, 230Delavirdine103, 181, 230, 236Efavirenz 100, 103, 108, 188L, 190, 225, 230,Protease Resistance Mutations,Indinavir10, 20, 24, 46, 63, 64, 82, 84, 90Nelfinavir30, 35, 36, 46, 71, 84, 88, 90Ritonavir8, 10, 20, 33, 36, 54, 63, 71, 82, 84, 90Saqui
23、navir10, 24, 30, 46, 48, 54, 63, 64, 71, 73, 77, 81, 84, 88, 90Amprenavir 10, 32, 46, 47, 50V, 54, 84Lopinavir/r10, 20, 24, 46, 53, 63, 71, 82, 84, 90Atazanavir48, 50L, 71, 84, 88, 90,Key mutations: Nucleoside RTI,M184V: high level resistance to 3TCK65R: Resistance to all nucleoside RTIs except AZT.
24、Selected by tenofovir and other NRTIs (except AZT)Thymidine analogue mutations (TAMs): 41, 67, 70, 210, 215, 219Affect susceptibility to d4T and AZT, abacavir (with multiple TAMs),Key mutations: Non-nucleoside RTI,K103N: high level resistance to efavirenz and nevirapineK188L: multi NNRTI resistanceU
25、sually resistance to one NNRTI leads to cross-resistance to other NNRTIs,Key mutations: Protease inhibitors,Generally multiple protease mutations needed to cause resistanceKey mutations: 90, 48, 50, 82, 845 or more mutations needed to confer resistance to lopinavir/ritonavirD30N is selected by nelfinavir, other PIs usually activeI50V selected by amprenavir, I50L selected by atazanavir during early virologic failure. Other PIs usually still active.,致谢：,本文参考了邵一鸣博士，李敬云教授，徐建青博士的幻灯。,谢谢！,
