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1、HE的染色基本原理,浙江省肿瘤医院病理科 李筠,一、细胞核的染色原理,细胞核内的染色质主要成份，去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色，苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。结果：细胞核呈蓝色，软骨基质，钙盐颗粒呈深蓝，粘液呈灰蓝。,灰蓝色,蓝色,深蓝色,二、细胞浆的染色原理,细胞浆内主要成份是蛋白质，为两性化合物，细胞浆的染色与PH值有密切关系，当PH调到蛋白质等电点4.75.0时，胞浆对外不显电性，同时酸或碱性染粒不易染色，当PH调剂68时，大于蛋白质的等电点时，表现酸性电离
2、，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，同时胞核也被染色，核和胞浆难以区分（阴离子）的染料染色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阴离子）结合而使细胞浆染色。结果：细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，如：胞浆内嗜酸性颗粒呈仅先强的鲜红，胶原纤维呈桔粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈桔红色；与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。,质量好HE具备条件,1. 细胞核与细胞浆蓝红相映，鲜艳亮丽；2. 胞核鲜明、核膜、核染色质颗粒均清晰可见；3. 组织或一般结构特点及假物质成分均能显示出来。,三、HE染色中二甲苯、酒精
3、和水洗的作用,1. 二甲苯的作用： 二甲苯可以溶解切片中的石蜡，以使染液可以进入细胞和组织，因此，石蜡的存在妨碍水和染料进入细胞，染色后二甲苯起透明切片的作用，以利于光线的透过。,2. 酒精的作用： 酒精用于苏木素前，由高低是为了洗脱用于脱蜡的二甲苯使水能进入细胞和组织中，伊红染色以后酒精由低高逐渐脱去组织中水份，为二甲苯进入细胞创造条件，否则组织切片透明度达不到光学显微镜观察时透光度的要求，在显微镜下不可能清晰的细胞和组织结构。,3. 水洗的作用： 在脱蜡酒精之后用水洗切片，使切片进入水，才能使苏木精染液进入细胞核中，使细胞核染色。,水洗目的：切片清洁，提高切片质量；切片着色均匀；防止不清洁
4、的切片污染染液，保持染液的清洁和纯度。染色之后的水洗：为洗去未与切片结合染液分化以后的水洗：中止分化作用伊红染色后的水洗：洗去未结合的染液，以防止大量伊红进入染缸,四、分化和蓝化作用,1. 分化作用,苏木素染色后，用水洗去未结合在切片中染液，但是对细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程称为染色的分化作用。,2.蓝化作用,分化之后苏木精在酸性条件下处红色离子状态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，而用弱碱水使苏木素染上细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般分用自来水浸洗变蓝，也可用稀
5、氨水或温水。,苏木素、伊红染色方法（自动染色机程序）,二甲苯 5分钟二甲苯 5分钟 二甲苯 3分钟无水乙醇 5分钟无水乙醇 3分钟无水乙醇 3分钟水洗 5分钟苏木素 13分钟水洗 3分钟,伊红 8秒水洗 2秒85%酒精 5秒95%酒精 5秒无水乙醇 3分钟无水乙醇 5分钟无水乙醇 5分钟正丁醇 5分钟二甲苯 5分钟,五、媒染染料,有些染料直接对组织染色时，由于染料与组织间的作用力弱，有时甚至无作用，因此组织着色很浅，甚至不着色，我们必须将这些染料先与媒染剂结合生成色淀的染料称为媒染染料（此类染料多为天染染料，如苏木精、卡红）。,六、媒染剂,凡由于和组织及染料结合，生成色淀，并促进染色的金属离子
6、盐类或金属原子的含氧酸等称为媒染剂。 间接染色过程中，媒染染料+媒染剂结合=色淀+组织结合 媒染剂+组织然后 再与染料结合，生成组织媒染剂染料结合物，从而使组织着色,七、促染剂,指只增强染料的染色能力，但不参与染色反应的一类物质。常见：伊红染液中冰醋酸。,八、染色过程中易出现的问题及原因,（一）染色过程中易出现问题及注意事项,1. 在进行染色操作前，进一步了解组织来源，固定、脱水、透明、包埋、切片的方法，因为这些处理因素对组织染色的效果都有直接影响，特别是固定液和固定时间与染色效果有特别重要的关系。,2. 染液的配制 时间：配制后染液不能久存再用 PH：如显示酸性粘液物质 配制方法及条件皆可直
7、接影响染色效果 如配制Hannis明矾苏木素染液加入氧化汞 温度过高或温度过低，从而影响染色,3. 保持染色剂和各种用具的清洁4. 染色时间问题：与染液新旧、温度、不同固定液固定时间长短,（二）切片脱落,1. 由于组织处理不当所致,组织本身的原因，如凝血块、血栓、干涸成过硬的组织及组织碎屑等；组织透明不足，石蜡不能浸透，切片时免强切出的片子脱蜡时大收缩，入水或染液后易脱落；组织脱水透明过度，浸蜡时间长或温度太高，引起组织收缩硬脆，不易切片完整切片。,2. 切片方面原因,切片过厚；薄片水温低，附贴不牢或附贴下含气泡；烤片时间长或温度高，蛋白甘油没能发挥贴附作用；载玻片清洗的不洁净，含有油赋或混入
8、尘污导脏东西。,3. 染色过程中的原因,脱蜡时未经自高至低的各级酒精的缓冲调解逐渐加水，用水急冲，振荡过甚；染液或试剂的酸碱度不适宜或停留时间较久，如HE返蓝所用碱性溶液过大时易引起脱落；染液或用具不洁净。,（三）染色不均,组织取材固定不当，如：组织取材过大或过厚，所用固定液浓度不对时，不能将组织固定透或固定不完全；切片厚薄不均或切片时出现横纹也能引起不均；染色处理不当引起染色不均的原因,a. 组织脱蜡不彻底； 原因：试剂陈旧，温度低b. 染液试剂量少时；c. 分化剂浓度大，分化过强； 原因：进行急速分化或在分化后没有迅速入水，使之终止分化均可造成染色不均d. 染色或分化时、组织切片上有气泡时
9、，则气泡内的组织可能染不上色或没分化着，使之染色不均。,（四）模糊不清,取材时组织已经腐败自溶或取材后没能及时固定和固定液浓度不够而组织出现自溶时，在染色组织切片上，往往是一片模糊；组织切片脱蜡不彻底，造成染色染不上或着色很淡，镜检时呈现模糊不清；染色后脱水不彻底，肉眼所见为云雾状，镜下模糊不清；封固切片时因空气潮湿，封片迟缓或呼吸造成切片上水珠，亦可出现模糊不清。,（五）切片污染,组织碎屑污染；染液及试剂污染；灰尘污染；霉菌污染。,九、易褪色的原因,染料的性质及染料与组织的作用问题特染过程中，如：VG染色其与组织形成的颜色不牢固，再加苦味酸能够分化及氧化酸性复红；制片过程中原因所致这类褪色是
10、指在不因褪色的时间内而出现褪色，如：HE的结果在几个月内就褪色了，这是因该造成其褪色的原因如下：,a. 固定不佳或或时间过久，固定液PH值不适宜；b. 脱水前组织没有经过流水冲洗；c. 染色时染液的酸碱度不适宜，如：HE染色时用碱性大的溶液返蓝，并经自来水长时间冲洗，就不易褪色，特别是伊红染液加促染剂冰蜡酸过多时，染色结果保持时间很短；,d. 组织切片染色后脱水透明失当；e. 封固时组织切片内混入水分，含有气泡封固剂稀或用量少，盖玻片小或不平，盖玻片位置不适当或被移动等，不但可致切片染色模糊不清，而且亦易褪色；f. 染色后的切片长期地置于日光或强烈高温的灯光下，尤其是暴晒于日光下最容易引起切片
11、褪色，另外，将封固后的切片加温烤干或室温过高时，一切能加速氧化易引起褪色。,十、染液的配制,1. 迈耶（Mayer）氏苏木素染液：,苏木素 0.5g 钾明矾 25g 碘酸钠 0.1g 水合氯醛 25g 柠檬酸 0.5g 蒸馏水 500ml 先将苏木精加入煮沸的蒸馏水内，搅拌充分溶解后，再次依次加入钾明矾和碘酸钠，至钾明矾全部溶解，然后加入水合氯醛和柠檬酸，加热煮沸后5分钟，冷却后过滤，放置812小时即可。,3. 伊红：,伊红y（醇溶） 2.4g 酒精 1000ml 微波炉高火 2分钟搅拌溶解冷却后加3ml的冰醋酸,2. 吉尔 （Gill）改良苏木素,苏木素 2g 无水乙醇 250ml 硫酸铝 17.6g 碘酸钠 0.2g 冰醋酸 20ml 蒸馏水 250ml 先将苏木素溶于无水乙醇中，再将硫酸铝溶于蒸馏水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加人冰醋酸。,3. 促染液：,碳酸氢钾 1g 硫酸镁 10g 自来水 500ml,谢 谢 ！,
