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1、免疫胶体金技术,免疫胶体金技术,一. 概述,(一) 发展历史 1971年 Faulk和Taylon 用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合, 制备成金标抗体, 检测细菌表面抗原的分布 1975年 Horisberger等 把胶体金技术推广应用于扫描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究 1978年 Geoghegan 发表了胶体金标记物在光镜水平的应用 1981年 Danscher 建立了银显影液增强，光镜,免疫胶体金技术,2,一. 概述(一) 发展历史免疫胶体金技术2,下金颗粒可见性的方法 1983年 Moeremans等 在蛋白质转移电泳中应用了免疫金银染色法 1986年 Fritz等 在免疫金
2、银法基础上成功进行了彩色免疫金银染色,免疫胶体金技术,3,下金颗粒可见性的方法免疫胶体金技术3,免疫胶体金技术以胶体金为标记物应用在免疫组织化学研究中，对细胞表面或细胞内的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子进行定位研究,免疫胶体金技术,4,免疫胶体金技术免疫胶体金技,（二）胶体金的基本概念胶体金，一般指金的水溶液，又称金溶胶。-金以微小的粒子分散在水中所形成的金 溶胶。其中分散的金颗粒直径在1100nm 之间。,免疫胶体金技术,5,（二）胶体金的基本概念免疫胶体金技术5,二. 胶体金的制备,(一) 可用多种方法制备胶体金分散法:包括机械分散法、超声波法、电分散法和胶溶法等 凝聚
3、法:包括物理凝聚法、化学凝聚法（氧化法、水解法和还原法） 其中应用最多的是化学还原法,免疫胶体金技术,6,二. 胶体金的制备(一) 可用多种方法制备胶体金免疫,化学还原法,【基本原理】在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。在适当条件下，还原的金原子凝聚成一定大小的金颗粒，形成金溶胶。【常用还原剂】柠檬酸钠、鞣酸、白磷等柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，15150nm白磷还原制备的金颗粒直径较小，312nm【具体制备方法】,免疫胶体金技术,7,化学还原法【基本原理】在氯化金水溶液中加,（二）影响溶胶稳定性的因素 电解质 胶体金浓度 温度 大分子物质,免疫胶体金技术,8,（二）
4、影响溶胶稳定性的因素免疫胶体金技术8,（三）胶体金的鉴定,【鉴定方法】在电镜下观察金颗粒的大小及金颗粒的均匀程度【鉴定方法】将胶体金滴在覆有Formvar膜或碳- Formvar膜的镍网上，空气干燥，透射电镜下观察，拍照，测量金颗粒的直径，并计算100个以上胶体金颗粒直径的平均值及标准差,免疫胶体金技术,9,（三）胶体金的鉴定【鉴定方法】在电镜下观察金颗粒的大小及金颗,（四）制备胶体金的注意事项,1. 玻璃器皿的清洁2. 试剂配制3. 影响胶体金颗粒大小的因素,玻璃器皿清洗清洁液浸泡24h 流水冲蒸馏水反复洗涤晾干,应尽量使用分析纯试剂各种水溶液必须用三蒸水或去离子水配制,加入还原剂的速度搅拌
5、是否均匀制备胶体金所用的烧瓶大小,免疫胶体金技术,10,（四）制备胶体金的注意事项1. 玻璃器皿的清洁玻璃器皿清洗,三. 胶体金探针的制备,(一) 胶体金与蛋白质结合的原理胶体金标记蛋白质的过程, 实际上是蛋白质在等电点或稍偏碱时, 被吸附于胶体金颗粒表面.,免疫胶体金技术,11,三. 胶体金探针的制备(一) 胶体金与蛋白质结合的原理免疫胶,（二）胶体金的预处理 标记之前将胶体金的PH值调至待标蛋白质的等电点或略偏碱调节PH的方法： 当需要提高胶体金的PH值时，用0.2mol/L K2CO3或0.1mol/L KOH 当需要降低胶体金的PH值时, 用0.1M HCL或醋酸,免疫胶体金技术,12
6、,（二）胶体金的预处理免疫胶体金技术12,(三) 待标记蛋白质的处理1. 透析除盐: 将蛋白质溶液装入透析袋中, 放 在蒸馏水中透析, 4过夜2. 离心: 10000 r/min, 4, 1h, 去除蛋白质聚 合物等沉淀,免疫胶体金技术,13,(三) 待标记蛋白质的处理免疫胶体金技术13,(四) 胶体金蛋白质最佳结合率测定 不同直径的金颗粒, 及不同分子量大小的蛋白质, 其结合的比例是不同的常用的检测二者结合量的方法有目测法和光电比色法,免疫胶体金技术,14,(四) 胶体金蛋白质最佳结合率测定免疫胶体金技术14,1. 目测法,先将待标记蛋白质逐级稀释 取一批小试管，编号，每管内加已调好PH的胶
7、体金100ul 按从低高的浓度，将已稀释好的蛋白溶液，分别加入已编号的试管中，对照管只加不含蛋白的稀释液，混匀，静置5 10 min 各管分别加10%NaCl 10l，混匀，静置2hr，观察结果,免疫胶体金技术,15,1. 目测法 先将待标记蛋白质逐级稀释免疫胶体金技术15,1,2,3,4,5,7,6,胶体金(ml) 1 1 1 1 1 1 1蛋白质(ug) 5 10 15 20 25 30 3510%NaCl 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1,结果判断: 对照管或加入蛋白量不足，胶体金出现由红变蓝的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金保持红色不变,免疫胶体金
8、技术,16,123 4576胶体金(ml) 1,2. 光电比色法,利用分光光度计测各管580nm的OD值, 然后以OD值为纵坐标, 蛋白质浓度为横坐标作一曲线, 取曲线最先与横轴相接近的那一点的蛋白质浓度, 即为最适稳定量.,免疫胶体金技术,17,2. 光电比色法利用分光光度计测各管580nm的OD值,(五）标记,1. 计算所需待标记蛋白质的总量 根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总量2. 调节PH：根据所标记蛋白质的等电点来调节胶体金的 PH,免疫胶体金技术,18,(五）标记1. 计算所需待标记蛋白质的总量免疫胶体金技术18,免疫胶体金技术培训
9、课件,3. 磁力搅拌下，逐滴加入蛋白质溶液，作用 515min4. 继续磁力搅拌，加入5牛血清白蛋白，使其终浓度为1，搅拌10min；也可加3聚乙二醇，使其终浓度为0.05,免疫胶体金技术,20,3. 磁力搅拌下，逐滴加入蛋白质溶液，作用 515min免,（六）标记探针的纯化,纯化的目的 去除溶液中未标记的 蛋白质，未充分稳定的胶体金，以及在标记过程中可能产生的各种聚合物 纯化的方法 超速离心法和凝胶过滤法,免疫胶体金技术,21,（六）标记探针的纯化 纯化的目的免疫胶体金技术21,1. 超速离心法,速度快，适合大样品的制备 离心 1500 r min，20min 弃沉淀 超速离心 4 1h 弃
10、上清 沉淀用PBS或TBS缓冲液（含0.1牛血清白蛋白重新悬浮至原体积的 1 101 20 离心 1500 r min，20min 弃沉淀 分装 4 保存,免疫胶体金技术,22,1. 超速离心法速度快，适合大样品的制备免疫胶体金技术22,2. 凝胶过滤法,将探针溶液装入透析袋内， 4 ，置于硅胶或聚乙二醇中浓缩至原体积的1 41 5 离心 1500 r min，20min 弃沉淀 经Sephacryl（丙烯葡聚糖）S400层析柱分离纯化。用0.02mol/L TBS(0.1%BSA)洗脱 TBS的PH根据蛋白质种类而定 按红色深浅分管收集洗脱液,免疫胶体金技术,23,2. 凝胶过滤法 将探针溶
11、液装入透析袋内， 4 ，置于硅,(七) 标记探针的鉴定,1. 负染色检查: 将胶体金溶液滴在覆有Formavar膜(支持膜) 的镍网上, 空气中干燥, 醋酸铀负染, 透射电镜下观察2. 生物活性鉴定: 可用直接或间接法放射免疫测定, 凝聚试验及免疫组化染色进行鉴定,免疫胶体金技术,24,(七) 标记探针的鉴定1. 负染色检查: 将胶体金溶液滴,四. 免疫胶体金染色方法,免疫胶体金技术,25,四. 免疫胶体金染色方法免疫胶体金技术25,(一)免疫金染色法 Immunogold staining, IGS,【基本原理】 1. 直接法-将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色,然后在光镜或电镜下观察 方
12、法简单, 但一种探针仅限于检测一种抗原, 较局限 2. 间接法-先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合, 然后加金标二抗或SPA与一抗结合, 在光镜或电镜下对抗原的分布进行定位研究,免疫胶体金技术,26,(一)免疫金染色法 【基本原理】免疫胶体金技术2,免疫胶体金技术,27,免疫胶体金技术27,【特点】 1. 阳性部位显红色 2. 染色程序简便, 不需显色或显影过程 3. 但一般要求金颗粒的直径20nm, 并要求用 高浓度的免疫金溶液,免疫胶体金技术,28,【特点】免疫胶体金技术28,(二) 免疫金银染色法Immunogold silver staining, IGSS,1983年 Holg
13、ate及其同事在IGS的基础上与银显影方法相结合, 建立了免疫金银法【基本原理】经免疫反应沉积在抗原位点处的胶体金颗粒作为一种催化剂，在对苯二酚存在的情况下，将显影液中的银离子催化还原成银原子，可将抗原位点清楚显示出来,免疫胶体金技术,29,(二) 免疫金银染色法1983年 Holgate及,1. 光镜免疫金银法 在免疫金染色的基础上增加物理显影的步骤 显影液的配制及显影过程应在暗处进行 阳性部位呈黑色颗粒状2. 电镜免疫金银法 包埋前染色, 包埋后染色,免疫胶体金技术,30,1. 光镜免疫金银法免疫胶体金技术30,【IGSS法优点】,1. 可被用于光镜和电镜观察 2. 敏感性高 3. 定位准
14、确 4. 背景清晰, 对比度好 5. 方法简便, 安全 6. 成本较低, 标本可长期保存,免疫胶体金技术,31,【IGSS法优点】 1. 可被用于光镜和电镜观察,(三) 彩色免疫金银染色法 Coloured IGSS, CIGSS,【基本原理】 组织切片经IGSS染色后, 抗原抗体反应部位生成的银颗粒通过铁氰化钾和溴化钾的作用, 使银原子被氧化生成金属银; 而彩色显影剂本身则被氧化, 其氧化产物使彩色剂由无色变为有色染料, 并沉积在银颗粒的部位, 而银颗粒被溶解【优点】 特异性高, 彩色影象鲜明, 应用范围广,免疫胶体金技术,32,(三) 彩色免疫金银染色法【基本原理】免疫胶体金技术32,五. 免疫胶体金技术的特点,1. 胶体金制备简便2. 标记简单3. 特异性强4. 敏感性高5. 定位准确6. 适应性广7. 易于双重和多重标记,免疫胶体金技术,33,五. 免疫胶体金技术的特点1. 胶体金制备简便免疫胶体金,
