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1、试管动物技术,概念,指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。,试管牛（两头小牛）,海福特肉用牛,蒙古黄牛,荷斯坦奶牛,意义（以良种牛的繁育为例）,意义,大量节省购买种畜的费用加速了良种畜的繁殖速度,一、体外受精,（2）过程：（一）卵母细胞的采集和培养（二）精子的采集和获能（三）获能精子和卵细胞的受精,1、体外受精（1）概念：采取雌性动物的卵细胞和雄性 动物的精子，使其在试管受精。,“试管动物”,（一）卵母细胞的采集和培养,对不同动物,采取卵母细胞的方法不同,一是：活体采卵二是：从已屠宰的母畜的卵巢中采卵,牛活体采卵示意图,（一）卵母
2、细胞的采集和培养,对不同动物,采取卵母细胞的方法不同,一是：活体采卵二是：从已屠宰的母畜的卵巢中采卵,牛活体采卵示意图,（一）卵母细胞的采集和培养1.活体卵巢上采集 超排处理：用促性腺激素处理，使其排出更多 的卵子，然后可 A:从输卵管中冲取卵子。 B:借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等工具 直接采集从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。,2.屠宰后卵巢上采集 无菌采集，放入3039灭菌生理盐水，6h内带回实验室。（1）卵巢表面卵泡卵母细胞的获得 采集方法3种。抽吸法：用注射器配上12或18号针头，以PBS为抽卵 液，从卵巢表面抽吸卵泡。切割法：用刀片反复切割卵泡，然后用PBS（添加5% 的犊牛血清
3、）沿切口反复冲洗卵巢，回收。剥离法：剥离突出于卵巢表面的卵泡，放在卵母细 胞培养液中，然后用针刺破眼科剪剪破卵 泡，回收。（2）卵巢内卵母细胞的获得 用单面刀片或一组特制刀片对卵巢深层组织进行切割。可获得更多的COC。,（二）精子的采集和获能,1.精子采集方法,假阴道法手握法电刺激法动物被处死后，从附睾尾收集精液（啮齿类的实验动物）,家畜采精用假台畜,2.精子的获能处理,培养法：化学诱导法：,人工配制的获能液处理（啮齿类动物、 家兔、猪等动物精子）,一定浓度的肝素溶液或钙离子载体 A23187溶液处理（牛、羊等动物精子）,（三）体外受精,在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程,新鲜或解冻的精
4、液,精子离心处 理,精子获能处理,二、胚胎的早期培养,1.培养液：两盐：无机盐、有机盐类两素：维生素、激素两酸：氨基酸、核苷酸一清：动物血清,2.用于胚胎移植的胚胎一般在原肠胚以前。,不同胚胎移植的时间：,动物,胚胎移植时间,牛、羊,桑椹胚阶段或囊胚阶段,小鼠、家免,桑椹胚之前,816个细胞阶段,人试管胚胎,无菌采集卵巢，放入3039灭菌生理盐水，6h内带回实验室。,将获得的卵母细胞进行分级，至少有包被1层以上致密卵丘细胞、形态正常的卵母细胞才可进行成熟培养。,在选择卵母细胞时，无论用哪种方法采集到的卵母细胞，外围一般都应该有数层卵丘细胞所包围，形成一个叫卵丘复合体的结构（COC）。这种结构对
5、于卵母细胞在体外条件下的成熟是十分重要的。在对家畜体外受精的操作中，一般把未成熟的卵母细胞分成A、B、C、D四级。对A级卵母细胞要求是有3层以上的卵丘细胞包围，卵母细胞的细胞质均匀；B级是少于3层卵丘细胞，但卵母细胞质要均匀；C级为没有卵丘细胞包围的卵母细胞，又称裸卵，培养效果很差；D级是退化或死亡的卵母细胞，应淘汰。A、B两类卵母细胞培养效果较好。,发情期牛输卵管液中氨基多糖（GAG）是牛精子体内获能的主要物质。GAG可促进精子对钙离子的吸收，从而引发顶体反应。肝素是高度硫酸化的GAG。咖啡因能够增强夺素的诱导作用。 在精子获能过程，BSA可以降低精子顶体膜中胆固醇的浓度，有利于顶体反应。精子获能之后，BSA可促进其迅速透卵子。因此，BSA作为辅助成分广泛用于家畜精子的体外获能。,
