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1、免疫学检测方法中的干扰因素和对策,第二军医大学附属长海医院实验诊断科,沈 茜,免疫学检测方法中的干扰因素和对策第二军医大学附属长海医院实验,随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学理论的建立，使大量免疫学检测技术被不断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用中也不断地推陈出新。目前应用免疫学原理检测的检验项目占到三级综合医院检验科全部检验项目的14，医疗收入约占13。这就要求检验人员不断掌握最新的临床免疫学知识和各种新的检验方法，了解检验项目的基本原理。,随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学理,生化,临检,要保证实验结果的正确性和可靠性，必须对实验整个过程中各个环节中的干扰因素有比较清楚的掌握和了解。在
2、本次课中主要讨论的是标本本身内在因素、以及由于人为因素对标本处理不当等引起的外在因素、对免疫检测结果造成的影响。在了解这些因素的同时，如何在临床工作中注意和解决这些干扰，以保证结果的准确性。,生化临检 要保证实验结果的正确性和可靠性，必须,基本概念,抗原：是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答、并能与相应免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。,抗体： 是由抗原刺激B细胞经分化增殖形成的浆细胞合成和分泌的，能与相应抗原发生特异性结合并具有多方面免疫功能的球蛋白。,基本概念 抗原：是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应,基本概念,免疫学检测就是利用抗原和抗体高度特异性结合的
3、原理而检测分析微量物质的方法。从20世纪50年代美国学者Berson和Yallow发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进步。,基本概念 免疫学检测就是利用抗原和抗体高度特异性,免疫测定技术均是以标记物示踪作为基础，同位素、荧光素、酶是经典的三大标记免疫测定技术。这三大标记技术发展了各种各样的免疫测定方法，如RIA、ELISA、荧光免疫测定、免疫化学发光测定等，目前应用这三大标记技术的检测试剂盒在临床广为应用。近年来，作为免疫测定发展方向的非同位素标记技术以其敏感、安全等
4、倍受关注。,免疫检测技术- 标记物,免疫测定技术均是以标记物示踪作为基础，同位素,标本自身及前处理所造成的干扰因素 类风湿因子（RF） 嗜异性抗体 自身抗体 补体 纤维蛋白 溶血或黄疸 交叉反应物质 外源性物质,免疫学检测- 干扰因素,标本自身及前处理所造成的干扰因素免疫学检测- 干扰因素,干扰因素和对策- 类风湿因子,患者体内存在的类风湿因子能显著干扰许多免疫学检测方法，IgM、IgG型RF可以与免疫检测系统中的捕获抗体及标记二抗的Fc段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假性升高。RF对不同检测系统的干扰程度有所差异，影响程度并不与RF的浓度成正比 。目前，在临床工作中使用的免疫检测试剂盒大
5、部分均没有很好地防止RF干扰的措施，国外著名公司要好于国内公司。,干扰因素和对策- 类风湿因子 患者体内存在的类风,干扰因素和对策- 类风湿因子,收集10份RF311000IU/L的患者血清，在美国和欧洲66各临床实验室进行74个项目的免疫竞争法或免疫夹心法检测，仪器和试剂均配套。3445个结果中8.7为假阳性。错误高值结果中的21（所有结果的1.8）引起了临床的错误诊断，在使用RF吸附剂后再检测，错误结果得到纠正。39的假阳性结果也可在使用RF吸附剂后降低。,Clinical Chemistry 2002;48(11):20082016,干扰因素和对策- 类风湿因子 收集10份RF3,免疫学
6、检测中的干扰因素课件,免疫学检测中的干扰因素课件,免疫学检测中的干扰因素课件,RF的干扰对策,捕获抗体用F(ab)2替代完整的IgG 标本用连有热变性（63，10 min）IgG的 固相吸附剂（Euroimmune公司）处理（将 热变性IgG加入到标本稀释液或血清中同样 有效），4过夜离心后在检测； 检测抗原时，可以用终浓度0.1mol/L 2-巯 基乙醇(2- ME)等加入到标本稀释液或标本 中，使RF（IgM型）降解。,RF的干扰对策 捕获抗体用F(ab)2替代完整的IgG,干扰因素和对策- 嗜异性抗体,嗜异性抗体通常是指与其他种类动物的免疫球蛋白产生反应的人类抗体，具有广泛的种特异性。免
7、疫检测系统中大量使用单克隆抗体，嗜异性抗体可与啮齿类动物IgG的Fc段结合。这样嗜异性抗体既可与检测系统中的捕获抗体结合、又可和标记抗体结合，造成检测结果假阳性或假性升高。嗜异性抗体干扰的程度、频率与患者的疾病状态、年龄、性别等无关。,干扰因素和对策- 嗜异性抗体 嗜异性抗体通常是指,干扰因素和对策- 嗜异性抗体,将11261份血清标本使用荧光时间分辨免疫分析系统（PE公司，二步法、双位点）检测CEA，将缓冲液中加入小牛IgG 约210个病人、3.34.7%的标本出现假性升高；加入15mg/L热处理小鼠IgG（MAK33 ）（Roche）可将干扰降为0.86%；同浓度天然小鼠IgG无效；去除捕
8、获抗体或标记抗体的Fc段也可将干扰降至0.1%。,Clinical Chemistry 2002；48(4):613621,干扰因素和对策- 嗜异性抗体 将11261份血清,表1. 不同处理方法对嗜异性抗体干扰的排除,处理方法病人数频率（）1切除,干扰因素和对策- 嗜异性抗体,使用Access免疫化学发光检测系统测定TSH、PSA、HCG和皮质醇，前三项为双位点非竞争法，后为竞争法。160份标本测定HCG有5份（3.1%)假性升高；53份标本（37.9%)用嗜异性抗体吸附剂吸收后结果出现差异性下降；有4份标本的结果出现4SD的显著增高，使临床对结果的解释出现改变。,Clin Chem 2003
9、；49(7):11631169,干扰因素和对策- 嗜异性抗体 使用Access,嗜异性抗体的干扰对策,在标本稀释液或待检标本中加入过量的动 物Ig (s) ，但加入量不足或亚型不同时无 效（要与捕获抗体和标记抗体的Ig亚型相 同）。 捕获抗体使用F(ab)2，切除Fc段。,嗜异性抗体的干扰对策 在标本稀释液或待检标本中加入过量的动,干扰因素和对策- 自身抗体,嗜靶抗原的自身抗体，如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，能与靶抗原结合形成复合物，在免疫检测系统中均可对靶抗原的测定结果造成负性干扰。 判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干扰，因紧密结合患者的疾病诊断、病史、其他实验检查的结果综
10、合分析。如甲亢、甲低、I型糖尿病等。,干扰因素和对策- 自身抗体 嗜靶抗原的自身抗体,Erikssion等人采用针对cTnI中心稳定区域抗原位点的捕获和检测抗体，开发了新的cTnI检测方法，有利于具有cTnI自身抗体等干扰物质的标本。采用新方法和目前一商品化试剂盒共检测541份胸痛患者的血清，其中13.5%的标本cTnI两种方法检测均阳性，14.2 %的标本仅采用新方法检测阳性 。上述结果说明心梗患者存在cTnI自身抗体绝非特例 。,干扰因素和对策- 自身抗体,Clin Chem 2005;51(5):848-55,Erikssion等人采用针对cTnI,嗜靶抗原自身抗体的干扰对策,为避免以上
11、情况出现，解决的办法是：测定前标本需用理化方法将免疫复合物解离后再测定。解离液组成： 0.3%Triton X100 1.5%CHAPS 15%SDS100l标本、50 l解离液混匀，56 30分钟处理。,J Clin Microbiol 1999;37:18021808,嗜靶抗原自身抗体的干扰对策 为避免以上情况出,干扰因素和对策- 补体,免疫检测系统中捕获抗体在向固相包被中和标记抗体的标记过程中，抗体分子发生变构，其Fc段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q 可以将二者连接起来，从而造成假阳性。一些公司为了增加检测的敏感性，使用链霉亲和素包被固相，将捕获抗体用亲和素标记，此过程也可
12、引起捕获抗体的构象发生改变 ，造成假阳性或假性升高。,干扰因素和对策- 补体 免疫检测系统中捕获抗体在,补体的干扰对策,用终浓度1040mmol/L EDTA处理标本，灭活补体。 用53、10 min或56、30 min加热血清使C1q灭活。,补体的干扰对策 用终浓度1040mmol/L EDTA处,干扰因素和对策- 纤维蛋白,在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后1/2开始凝固，2h后完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时或未完全凝固时即强行离心分离血清，此时血清中仍残留部分纤维蛋白原，在免疫检测过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结
13、果，尤其是在使用ELISA检测时。,干扰因素和对策- 纤维蛋白 在没有促凝剂和抗凝,干扰因素和对策-纤维蛋白,用Abbott AxSYM分析了3962份血标本中cTnI 水平，其中307份cTnI升高，将这307份标本再离心前后测定cTnI的变化，24份标本在离心后cTnI有45%的降低，这种现象主要出现在cTnI含量在2.025g/L的标本。离心后其中20份样本cTnI值低于正常cutoff值。,Int J Cardiol 2005;101(1):27-31,干扰因素和对策-纤维蛋白 用Abbott Ax,为避免上述干扰作用，解决的办法最好是 血液标本采集后必须使其充分凝固再分离血清，或标本
14、采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。怀疑检测结果存在纤维蛋白干扰的标本，最好将标本410放置过夜，离心后再检测。,纤维蛋白的干扰对策,为避免上述干扰作用，解决的办法最好是 血液标本采集后必须使其,干扰因素和对策- 溶血或黄疸,各种人为原因引起的标本溶血，导致红细胞的破坏，血红蛋白以及细胞碎片和蛋白质等释放出来。溶血对免疫检测的作用不仅是游离血红蛋白的影响，更多的是细胞碎片和蛋白质等其他溶血产物；血红蛋白具有过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定中，会导致非特异性显色 。溶血因测定方法的不同可导致对免疫学检测的正向或负向干扰，且影响大小也有所差异。,干扰因素
15、和对策- 溶血或黄疸 各种人为原因引起的,干扰因素和对策- 溶血或黄疸,一项针对溶血对电化学发光法影响的研究发现，cTnT测定浓度的负偏倚与血清中血红蛋白浓度相关，血红蛋白浓度每增1g/L ，cTnT0.1g/L的可能性下降2.5% 。,Clinical Biochemistry 2004;37(8):398-701,标本中结合胆红素和未结合胆红素任一或两者含量的增高都会对采用免疫学原理的检测系统产生负干扰。,干扰因素和对策- 溶血或黄疸 一项针对溶血对电,干扰因素和对策- 交叉反应物质,待检标本中存在类地高辛、类AFP样物质等，是一些与检测的靶抗原有交叉反应的物质。在用多克隆抗体测定抗原时对
16、测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时 ，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，会出现假阳性结果。,干扰因素和对策- 交叉反应物质 待检标本中存在类,干扰因素和对策- 外源性物质,外源性物质常常是由于用于免疫测定的血标本采集、贮存等不当所致。 标本受细菌污染： 因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本在以辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定中，可产生非特异性显色而干扰测定结果。,干扰因素和对策- 外源性物质 外源性物质常常是由,标本管中添加物质的影响： 抗凝剂、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中HRP活性）及分离血清的分离胶等均对免疫检测有一定
17、干扰作用。应用三种检测系统分别测定100对同时采集的肌钙蛋白阳性的血清与肝素抗凝血浆两组标本，在两者测定值差异大于20%的结果中，ACS :Centaur cTnI占11%，Elecsys cTnT占9%，AxSYM cTnI占2%，其他的抗凝剂如EDTA抗凝的血浆肌钙蛋白测定结果也比血清低。,干扰因素和对策- 外源性物质,Clin Chem 2000;46(9):1338-44,标本管中添加物质的影响： 抗凝剂、酶抑,干扰因素和对策- 外源性物质,标本保存不当： 在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性；有
18、时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5天内测定的血清标本可存放于4，1周后测定的血清标本应低温冻存。,干扰因素和对策- 外源性物质 标本保存不当：,冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。,干扰因素和对策- 外源性物质,冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充,操作流程不当造成结果的改变,我们对HBV血清标志物五项指标仅抗-HBc总抗体单阳性的血清实行了严格的复检措施，发
19、现初、复检结果的符合率50%。偏差如此之大是无法用实验人员操作不当解释的。抗-HBc总抗体采用竞争抑制ELISA法检测, 日常工作中无论标本多少，必然是先加完血清标本后再加抗-HBc-HRP。这样，血清中的抗-HBc与抗-HBc-HRP存在着明显的“不公平竞争”。,操作流程不当造成结果的改变 我们对HBV血清,操作流程不当造成结果的改变,这种“不公平竞争”对实验结果的影响有多大？,操作流程不当造成结果的改变这种“不公平竞争”对实验结果的影,表2. 加样后放置时间对检测结果的影响,54(57.4) 43 18 12 21,表3. 在加样放置时间改变后阴性标本A450nm与结果的关系,放置时间mi
20、n,表4. 加样同时加入抗-HBc-HRP放置不同时间对检测结果的影响,放置时间min阴性标本数临界值标本A 450nm假阳,操作流程不当造成结果的改变,我们将临床抗-HBc总抗体的加样方式改为每加入10个标本，立即加入抗-HBc-HRP（时间控制在1min40s左右），直至标本全部加完，再共同37温育30 min。经过几万例临床标本的检验证实，表明这种加样方法明显减少了由于操作流程不当造成的结果假阳性，使检测结果的真实性得到一定的保证。,操作流程不当造成结果的改变 我们将临床抗-H,操作不当交叉污染,定性免疫测定已广泛用于感染性病原体抗原和抗体检测，目前国内应用最广泛的是ELISA等。由于测
21、定操作和(或)加样吸头重复使用的全自动加样系统的使用，常有标本间的交叉污染所致“拖带”现象致假阳性结果的出现。标本交叉污染不光是导致假阳性，亦会因为乙肝疫苗的普遍免疫，标本中存在的抗HBs 可使受污染标本中可能存在的HBsAg检测受抑，而致假阴性。,操作不当交叉污染 定性免疫测定已广泛用于感染性病原,操作不当交叉污染,经江苏省防疫站HIV确认中心确认，除E9孔所对应的标本为HIV阳性外，其余均为阴性。将这3份新标本进行ELISA 检测，结果与印迹法吻合。,操作不当交叉污染 样本号 孔位号S/CO均值复检,操作不当交叉污染,目前的全自动加样系统，不管是一次性加样针还是永久性加样针，均难以避免样本
22、的污染问题。特别是当遇到高浓度的抗原或抗体，沿加样方向被污染的甚至可能不止1 个孔。为了排除这种污染造成的假阳性，建议当同一行/列上（沿加样方向）出现连续阳性，并经复查仍为阳性时，应同时采取新鲜标本进行检测来加以证实。,操作不当交叉污染 目前的全自动加样系统，不管,交叉污染- 判断,当出现交叉污染时,如何从日常检测结果来判断假阳性的可能原因以及阴性质控或阳性质控成立，但测定结果中已存在假阳性或假阴性，如何从日常检测结果来观察? 在实验室日常检测阳性率比值呈正态分布时，可采用半LeveyJennings质控图法；不呈正态分布时则可用直接概率法。,中华检验医学杂志 2006, 29(2):1731
23、76,交叉污染- 判断 当出现交叉污染时,如何从日常,我科20天HBsAg 阳性率的变化,=0.112S=0.01982S=0.0396+2S=0.1516,检测次数 每次标本数 阳性数 阳性率,质控规则：当阴性质控样本为阳性时，不管阳性率测定比值为何，均为失控，所有阳性标本须重新测定。如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出+ 2SD，则为失控为1 + 2S规则。本次结果的阴性结果可根据阳性质控样本的情况决定是否可以发出；所有阳性样本结果不能发出，需查找出现阳性率增高的原因并重新检测。,质控规则：当阴性质控样本为阳性时，不管阳性率测定比值为何，均,免疫检测中值得注意的问题,钩状效应(Ho
24、ok effect),由于待检标本中抗原浓度的显著升高,而致捕获抗体不足所造成的检测结果假阴性或假低测定值。这种现象可以出现在任何免疫学检测中，一步法检测更易见。在我科已出现在： 时间分辨免疫荧光分析法 速率散射免疫比浊法 ELISA（一步法、二步法） 免疫滲透层析法,免疫检测中值得注意的问题钩状效应(Hook effect),在临床检测中密切关注Hook effect”的几个项目： 甲胎蛋白（AFP） HBsAg、HBeAg 免疫球蛋白 大便隐血（FOB） CA125,在临床检测中密切关注Hook effect”的几个项目：,“Hook effct”的预防和处理,依据患者的临床诊断 关注患者的其他实验室检查结果 不放过任何异常的测定值或模式 使用免疫滲透层析法快速验证 尽可能使用二步法进行检测,处理： 用正常人血清系列10倍稀释再检测,“Hook effct”的预防和处理 依据患者的临床诊断处理,免疫检测中值得注意的问题,检测使用一种试剂盒、复检必须使用另一种试剂盒，最好方法学也不一样。 HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe的检测最后可以使用“中和法”来鉴定。 抗HCV的检测目前国内外的试剂盒单独使用均有可能出现假阴性或假阳性，联合使用可以减少错误结果；并可用RTPCR鉴定。,免疫检测中值得注意的问题 检测使用一种试剂盒、复检必须使用,谢谢,谢谢,
