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1、免疫组化实验方法,免疫组化实验方法,最突出的优点,在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢结合起来，在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分，达到方法统一，定性可靠，定位准确，定量可能。,2,免疫组化实验方法,最突出的优点在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢结合起来，在,免疫组化实验标本,组织标本（石蜡切片和冰冻切片）细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂片）。石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档；,3,免疫组化实验方法,免疫组化实验标本组织标本（石蜡切片和冰冻切片）3免疫组化实验,细胞和组织的固定,1固定的作用-使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和
2、内源性酶活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。2选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10中性福尔马林液、4多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3常用的固定方法-浸入法和灌注法（适用于动物实验研究） 组织新鲜 勿干燥 体积
3、适中 固定液足够（20倍）,4,免疫组化实验方法,细胞和组织的固定1固定的作用-使细胞内蛋白质凝固、终止或,抗体,常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。特性比较：均一性2. 稳定性3. 特异性4. 重复性5. 沉淀反应,5,免疫组化实验方法,抗体常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。5免疫组化实验方法,荧光素标记抗体,能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素。必备条件: 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合物应无毒，附加抗原性小。,6,免疫组化实验方法,荧光素标记抗体 能够产生荧光并能作为染料的化合物
4、称为荧,免疫组化实验方法培训课件,染色的基本程序,标记抗体与标本中抗原反应结合；用缓冲液洗去未结合的成分；直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。,8,免疫组化实验方法,染色的基本程序标记抗体与标本中抗原反应结合；8免疫组化实验,反应条件,抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：（1）PH：中性及弱硷性条件（PH 78）有利于免疫复合物的形成（2）离子强度：0.010.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成（3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20，EDTA（0.01%），Triton X-100（0.11%）（4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质
5、可以减少抗体的非特异吸附，常用牛血清白蛋白（5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐（6）温度和时间：较高的反应温度（37）可加速抗原抗体结合反应，低温有利于抗原抗体结合率的提高（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇,9,免疫组化实验方法,反应条件抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：9免,荧光素,1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490495 nm，最大
6、发射光谱为520530 nm，呈现明亮的黄绿色荧光。最常用。2四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。3四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596600nm，呈橙红色荧光。价廉。,10,免疫组化实验方法,荧光素 1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isot,染色注意事项,（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。（2
7、）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右）（3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30。（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验摸索，找出最佳稀释度。（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻融次数。,11,免疫组化实验方法,染色注意事项（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。11免,酶标抗体法,通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原
8、成分定位观察。常用的酶-辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。,12,免疫组化实验方法,酶标抗体法通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底,抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-biotin peroxidase complex ABC),原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过
9、氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低 ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进行双染,13,免疫组化实验方法,抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-bioti,14,免疫组化实验方法,14免疫组化实验方法,15,ABC法的特点：敏感性强 特异性强，背景染色淡方法简便，节约时间可用于双重或多重免疫染色。,免疫组化实验方法,15ABC法的特点：免疫组化实验方法,16,免疫金染色原理：免疫金
10、染色技术使用胶体金耦联抗体，然后在光学显微镜下检测抗原。解决了免疫组化里内源性酶干扰的问题。整个检测过程中无需酶的参与，因此不必预先处理样本以消除内源性酶的活性。,免疫组化实验方法,16免疫金染色原理：免疫金染色技术使用胶体金耦联抗体，然后,免疫组化试剂的正确选择和使用,17,免疫组化实验方法,免疫组化试剂的正确选择和使用17免疫组化实验方法,一抗1. 首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。2. 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭液（可以是BSA或二抗来源
11、的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性结合位点。3. 跨膜分子的抗体选择：要注意免疫原是整个蛋白分子或是胞外区、胞内区。对于胞内区抗体，染色时需要使用穿孔剂，而胞外区抗体不必使用。4. 正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但常常需要重新选择比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作倍比稀释。,18,免疫组化实验方法,一抗18免疫组化实验方法,19,二抗种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠原性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠I
12、gG1, 可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作5倍比稀释。,免疫组化实验方法,19二抗免疫组化实验方法,20,设立阳性对照和阴性对照-证明实验系统的正确性1. 阳性对照：主要涉及所用缓冲液、稀释液、二抗和检测系统等因素。尤其在结果出现无信号时，为查找原因提供重要线索。2. 阴性对照：一种是自身对照（常用），指测试组织本身非抗原表达部位。一种是外部对照，指已证实不表达检测抗原的组织。,免疫组化实验方法,20设立阳性对照和阴性对照免疫组化实验方法,21,试剂保存-抗体试剂保存：抗体浓度越高越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15NaN3防腐剂以延长保存时间。 酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。抗体浓缩液应在-20保存，可以长达两年；用时取出，室温融解，如一次或短时间用不完，应进行小量分装，-20保存，避免反复冻融；融解后抗体于28可以保存一个月。,免疫组化实验方法,21试剂保存-抗体试剂保存：免疫组化实验方法,
