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1、免疫组化技术及注意事项,免疫组化技术及注意事项,免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原 (多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。,免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记,抗原抗体的特异性结合,抗原抗体的特异性结合,免疫酶法 以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位 酶降解底物的量与色泽浓度成正比，可反映被测定的抗原或抗体
2、的量 常用的标记酶：HRP、AP、GOD,酶标抗体法,非标记抗体酶法,免疫酶染色方法,直接法,间接法,酶桥法,PAP法 (过氧化酶抗过氧化酶法 ),免疫酶法 酶标抗体法非标记抗体酶法免疫酶染色方法直接法间接法,免疫荧光法用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原 荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪 借助于荧光显微镜进行观察 常用的荧光素 ：异硫氰酸荧光素 (FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC)、四乙基罗丹明 (RB200) 、碘化丙啶 (PI) 等免疫荧光染色法常用的有直接法和间接法,免疫荧光法,
3、延髓A2区中Fos和TH荧光染色,延髓A2区中Fos和TH荧光染色,大脑神经干细胞,大脑神经干细胞,亲和组织化学法是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。常用的有：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 (ABC法)、链亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 (SP法) 。,亲和组织化学法,束缚-浸水应激引起的孤束核中Fos蛋白的表达(SP法),束缚-浸水应激引起的孤束核中Fos蛋白的表达(SP法),小鼠海马神经GFAP蛋白表达,小鼠海马神经GFAP蛋白表达,1、实验前准备,1.1 查阅相关文献资料中文：山师图书馆中文电子
4、资源，清华同方、 北京万方、重庆维普期刊全文数据库。英文：National Center for Biotechnology Information (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) 山师图书馆外文电子资源，Springer、 ProQuest、Kluwer全文数据库，或试用电 子资源。,1、实验前准备1.1 查阅相关文献资料,免疫组化技术及注意事项课件,1.2 所用抗体的选择和购买参考文献设计实验选择抗体种属来源：一抗常见兔、鼠、山羊、豚鼠单或多克隆抗体：前者贵特异性高，后者相反双标或三标的要求：不同的一抗种属来源二抗选择和目标一抗同型或同亚型的抗体，IgM，IgG1
5、，2a，2b等。公司：最好是国外著名生产抗体的大公司,1.2 所用抗体的选择和购买,购买抗体抗体的实际使用范围：IHC-P, IHC-Fr, ICC, IF, IP, WB, E特异性，交叉反应一抗、二抗都能找到对应动物源后再订购索取抗体一般已发表文献中描述的抗体，只需向作者礼貌地提出申请均能获得，只有当多抗已用尽或供应非常短缺，作者才会婉转拒绝。,购买抗体,制备抗体多克隆抗体的制备 多克隆抗肽的抗血清是用天然蛋白抗原或肽-载体蛋白偶联物作为抗原来制备得来的。可应用肌肉注射和皮下组织注射免疫法制备抗血清，然后用亲和层析法进行特异性抗体纯化制备抗肽抗体的流程图,制备抗体,免疫组化技术及注意事项课
6、件,单克隆抗体技术,单克隆抗体技术,1.3 抗体的保存抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定，易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15NaN3防腐剂以延长保存时间。酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。抗体浓缩液-20保存两年，融解后抗体于2-8可以保存一个月，稀释抗体在4下可存放1-3天，超过7天效价显著降低。,1.3 抗体的保存,1.4 抗体的分装阅读抗体的说明书：背景、抗原、应用、保存分装：在洁净的环境下无菌操作，是否避光液体抗体：冰盒内直接分装，最少 10L/每管干粉抗体：重构 (最好用超滤水)，
7、加甘油 (-20)分装的抗体密封，存储 (4 or -20)，荧光抗体锡箔纸包裹避光用时取出一管， 存于4，避免反复冻融，用前稀释。,1.4 抗体的分装,免疫组化技术及注意事项课件,2、预实验,2.1 掌握各种技术制作束缚-浸水应激模型,2、预实验2.1 掌握各种技术,灌流固定脑组织：免疫组化染色的关键第一步，常规4%多聚甲醛/PBS。长时间固定会使组织抗原的检出强度逐渐降低。脑组织和脑切片的保存：包埋剂包埋快速冷冻，-20保存防冻液 (20%丙三醇、30%乙二醇、50%PBS)中-20保存异戊烷中-70 保存贴片脑切片室温晾干，-20 -80的冰箱保存,灌流固定脑组织：免疫组化染色的关键第一
8、步，常规4%多聚甲醛/,脑立体定位冰冻切片减少冰晶:速冻或2030%蔗糖溶液4 脱水防止切片脱落：清洗载玻片，粘附剂处理脑切片染色：中性红、焦油紫、苏木精等,脑立体定位,中性红染色的大鼠脑切片,中性红染色的大鼠脑切片,2.2 免疫组化的方法贴片法： 孵育盒放平，防止切片干涸,2.2 免疫组化的方法,漂片法：轻摇小瓶或培养板，使切片充分接触抗体，冲洗充分,漂片法：轻摇小瓶或培养板，使切片充分接触抗体，冲洗充分,2.3 抗体最佳稀释度确定直接测定法：用已知阳性抗原切片进行免疫染色，标准是该浓度可使抗原特异且明显染色但背景无染色,2.3 抗体最佳稀释度确定一抗稀释度特异性染色非特异性染色1,棋盘法：
9、测定两种以上抗体的最佳配合稀释度,括号内为背景染色结果,棋盘法：测定两种以上抗体的最佳配合稀释度 第 一 抗 体第二,2.4 免疫组化染色对照的设计 免疫组化的质量取决于正确使用各种对照，没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照的设置在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。 主要是针对一抗的对照，包括阴性对照、阳性对照和自身对照。,2.4 免疫组化染色对照的设计,阴性对照空白对照：用PBS 代替第一抗体替代对照：用正常血清代替第一抗体抑制对照：标本加未标记的特异性抗体，再加酶或荧光标记的特异性抗体吸收实验对照：将足量的抗原 (如SP)加入相应的一抗 (抗SP血清)孵育、离心、取上清液
10、作为第一抗体,阴性对照,阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片应呈阳性自身对照 同一切片上，不同组织成分或不同部位或神经核中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如应为阳性的组织或部位是阳性，则免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。,阳性对照,替代对照,PVN中Fos表达,替代对照PVN中Fos表达,3、免疫组化正式实验,3.1 步骤,组织固定,冰冻切片,阻断内源性酶,封闭处理,一抗处理,二抗处理,显色复染,脱水透明封片,3、免疫组化正式实验3.1 步骤组织固定冰冻切片阻断内源性酶,3.2 注意事项组织固定 保持细胞固有形态
11、和结构，保存组织细胞的抗原性固定液的选择 ：免疫组化技术成功与否的基础。不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouins液、Zanbonis液、Karnovskys液组织固定时间：最好在l2h内，一般不应超过24h。随着固定时间的延长，组织抗原的检出强度将逐渐降低 固定方法：浸入法和灌注法,3.2 注意事项,去除生物体自身含有的内源性酶灭活碱 (酸)性磷酸酶：左旋咪唑 (24mg/mL)加入底物液中并保持pH7.68.2能除去大部分内源性碱性磷酸酶，酸性磷酸酶可用0.05mol/L酒石酸抑制。去除内源性过氧化物
12、酶：0.33过氧化氢甲醇液孵育1030min。甲醇对各种酶，都有钝化的作用。,去除生物体自身含有的内源性酶,去除内源性生物素 正常组织细胞中含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性采用生物素方法染色前，将组织切片浸于0.01%卵白素溶液室温处理20分钟，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。,去除内源性生物素,合理地使用封闭试剂一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，因为抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分非特异性地结合要消除电荷吸附所造成的非特异性背景染色，可用二
13、抗动物的210%非免疫血清或12%牛血清白蛋白，以封闭吸附位点,合理地使用封闭试剂,抗体的配制根据一次实验所需的抗体量来决定配制的抗体量。配制抗体的微量取样器一定要准确，最好专用。根据抗体的使用说明书配制，一般可加去垢剂 如TritonX-100、 Tween-20等 一抗孵育可在4过夜，或室温或37 几小时,抗体的配制,PBS的冲洗冲洗的PBS为一次性，防止交叉污染温柔冲洗，冲洗时间足够，一般冲洗35次PBS的pH和离子强度的使用和要求 ，中性及弱碱性条件 (pH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解,PBS的冲洗,
14、显色系统辣根过氧化物酶 (HRP)：DAB或AEC显色DAB配制完后最长放置30 min，DAB显色最长不宜超过10 min。增强显色的方法：应用金属离子或有机复合物溶剂在显色液中可增强DAB的显色效果。包括铜、锇、银、钴、镍、及米唑等。加入1重金属离子 (1：50)，可使显色明显增强，并发生变色反应。以Ag、Co、Ni离子最好。,显色系统,AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片以水性封片剂为主，染色切片不能久存。碱性磷酸酶 (AP)：最好选用NBT/BCIP，而AP-Red、AP-Qrange、Fas-Red染色结果均不能长期保存,AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片以水性封片剂为
15、主，,3.3 非特异性染色的出现逐一查找原因是否有效地去除内源性酶非免疫血清封闭是否正确一抗要合适，过高的浓度极易出现非特异性每步的冲洗是否干净组织切片在操作过程中是否曾经干涸 DAB配置、使用、浓度是否准确检测系统是否与组织内源性蛋白有交叉反应,3.3 非特异性染色的出现逐一查找原因,4、免疫组化阳性结果的统计,Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象,照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的黄度来反映相应蛋白表达的的量,4、免疫组化阳性结果的统计Image-Pro Plus的主要,4.1 校正光密度,图片的光强单位与测量中的光密度单位的不
16、一致 计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度gray=255 光密度OD值：为吸收光线物质的光学密度,4.1 校正光密度图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致,未校正前，IPP用的是gray灰度单位。浅色处灰度值大，深色处灰度值小光密度校正的目的就是让照片上亮的、白的、染色浅的点的OD值显示为接近于零的小的数值，让暗的、黑的、染色深的阳性区域点的OD值显示为较大的数值光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转换，从灰度数值转换为光密度数值单位,未校正前，IPP用的是gray灰度单位。浅色处灰度值大，深色,校正光密度的具体方法 点measure - calibaration intensity点窗口里的 new按纽，新建一个caliberation set，在下面点击std optical density。再点一下左上方的system按纽。,校正光密度的具体方法,免疫组化技术及注意事项课件,4.2 校正标尺4.3 Count4.4 统计,4.2 校正标尺,Thanks,Thanks,
