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1、第十五章 免疫细胞功能检测技术,第一节 淋巴细胞的功能检测,淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定,淋巴细胞,T细胞（负责细胞免疫功能）B细胞（执行体液免疫功能）NK细胞（非特异性免疫作用）,一、T细胞功能的检测,T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验,（一）T淋巴细胞增殖试验,1. 原理：,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,2. 淋巴细胞转化
2、的刺激物,非特异性刺激物： PHA -T细胞 ConA -T细胞 PWM -T、 B细胞 LPS -B细胞特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原,3. 检测方法,形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h） DNA合成期 + 3HTdR掺入 收集细胞 检测射线,测定细胞内的3HTdR,（1）形态学检查法,方法学评价：,优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。,（2）3H-TdR掺入法,优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：
3、但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,MTT,测吸光度,(3) MTT 比色法,(二) T细胞分泌功能测定,体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。,（三）T细胞介导的细胞毒试验,1.原理：,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞,2.方法,意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力,51Cr释放法,(四) 体内试验,特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验,二、B细胞功能检测,B细胞增殖能力的试验溶血空
4、斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验,(一)B细胞增殖能力的试验,抗IgM细菌脂多糖SAC的SPA,B细胞增殖,形态学,3HTdR掺入法,(二) 溶血空斑试验,1. 原理：,2. 方法学：,经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验,3临床应用与评价,溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。,(三) B细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法,1.原理：,2应用与方法学评价：,该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
5、,(四)体内试验,体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。,染色计数,离心取上清测LDH或AKP,离心取沉淀测活细胞荧光,测发光强度,测CPM值,形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法,三、NK细胞活性测定,靶细胞溶解,常用靶细胞: K562细胞株,第二节 吞噬细胞功能检测技术,按其形态大小分为两类：大吞噬细胞单核-吞噬细胞系统小吞噬细胞中性粒细胞,吞噬细胞的功能：,趋化 吞噬 胞内杀灭作用,一、中性粒细胞功能的检测,
6、细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测,(一) 细胞运动功能趋化功能检测,1.原理：,2. 方法学：,琼脂糖平板法,滤膜渗透法（Boyden 小室法）,(二)吞噬和杀菌功能测定,1显微镜检查法：,2. 溶菌法,NBT还原试验,原理：,N-N-C + H+N=N-R-,N-NH2C N=NH,四氮唑基（淡黄色）,甲chan（紫黑色）,3NBT还原试验,中性粒细胞,NBT,甲撍颗粒沉积于胞质中,二、巨噬细胞功能检测,(一)炭粒廓清试验,正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度
7、，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。,(二)吞噬功能检测,巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。,(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定,1酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法2非特异性酯酶的测定 常用-萘醋酸法,(四) 细胞毒作用测定,用IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。,(五) 巨噬细胞促凝血活性测定,激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经37预温的正常兔血浆和
8、CaCl2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37，即时记录血浆凝固时间。,反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。,第三节 免疫细胞功能检测的临床应用,思考题,T细胞功能检测内容有哪些？什么是T细胞增殖试验的原理、刺激物及方法学？何谓T细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？何谓结核菌素皮肤试验？B细胞功能检测的方法学有哪些？何谓溶血空斑试验的原理和方法学？NK细胞活性测定的方法学有哪些？中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。巨噬细胞功能检测方法学及相应原理。免疫细胞功能检测的临床应用有哪些？,重点,免疫细胞功能检测试验名称,选择题,1.Boyden小室常用于测定（ ）A.白细胞吞噬功能B.中性粒细胞趋化功能C.白细胞杀伤功能D.淋巴细胞抑制功能E.白细胞调理功能,2.溶血空斑试验用于检测下列何种细胞的功能（ ）A.T细胞B.B细胞C.中性细胞D.吞噬细胞E.NK细胞,3.T细胞增殖试验的检测方法（ ）A.滤膜渗透法B.3H-TdR掺入法C.酶联免疫斑点法D.51Cr释放法E.NBT还原法,谢谢！,
