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1、细胞工程实验指导目录实验室安全守则3实验操作须知5实验一 培养基母液的制备8实验二 培养基的配制与灭菌12实验三 培养材料灭菌和接种16实验四 愈伤组织的诱导与增殖19实验五 愈伤组织的分化21实验六 植物细胞悬浮培养与同步化22实验七 细胞微室培养23实验八 原生质体培养24实验九 烟草原生质体融合26实验十 烟草叶片组织培养28实验十一 月季组织培养29实验十二 菊花组织培养与快速繁殖30实验十三 马铃薯茎尖脱毒32实验十四 马铃薯试管微薯的诱导33实验十五 小麦幼胚培养34实验十六 小麦成熟胚培养36实验十七 小麦花药培养38实验十八 生物反应器中芹菜体胚发生的大规模培养39实验十九 植
2、物细胞的生长计量技术41实验二十 烟草遗传转化实验45实验二十一 细胞原代培养46实验二十二 细胞传代培养48实验二十三 细胞的冻存和复苏49实验二十四 细胞的分裂指数51实验二十五 细胞周期的测定52实验室安全守则一般规定 1、上课第一天请先熟悉环境，察看紧急冲洗站、洗眼站、灭火器、急救箱及安全梯等的位置，牢记“安全”是进行任何实验最重要的准则。 2、在实验室內请穿着实验服，避免穿凉鞋、拖鞋。留有长发者，戴帽套将头发捲入套內，或以橡皮筋束于后，以防止引火危险或污染实验。 3、在实验室内禁止吸烟、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服及杂
3、物等。 4、所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得带出实验室。每组分配的仪器、耗材请确定清点与保管，课程结束后如数清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用，实验前后，请把工作区域清理擦拭，并随时保持环境卫生。 5、实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作规程，注意上课所告知的注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，确切记下自己的结果，严禁抄袭，确定关闭不用的电源、水、酒精灯及煤气等。 6、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验室过夜。 7、
4、实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及电源，离开实验室前记得洗手。 8、任何意外事件应立即报告师长，并应熟知相关的应急措施。 药品1、使用任何药品，请先看清楚标示、注意事项，翻阅物质安全资料表，查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2、新配制的试剂请清楚注明内溶物、浓度、注意事事项及配制日期，为避免污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3、挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、b-mercaptoethanol、酚等）要在通风橱中戴手套量取配制，取用完后随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4、有毒、致癌药剂例如acrylamide（神经毒）、e
5、thidium bromide（突变剂）、SDS、秋水仙素请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，应养成洗手的好习惯。 5、接触到病原材料或细菌，应迅速消毒。所有被污染的物品，在丢弃或重复使用前均需先灭菌，固体培养基不得倒入水槽或下水道中。 6、使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或安全吸球。 仪器1、使用仪器前先了解其性能、配置及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸，勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2、使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，锁紧离心机转陀。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3、实验时不要用潮湿有汗的
6、手去操作电器，不要用手紧握可能荷电的电器，不应以两手同时触及电器，电器设备外壳均应接地。万一不慎发生触电事故，应立即切断电源开关，对触电者采取急救措施。 4、使用微波炉加热时，不可有铝箔等金属物品，瓶盖必须松开，以免爆炸。加热后戴防热手套取出瓶子。5、使用UV灯时，不要以眼睛直视UV，应隔着挡板观察，完毕立即关灯。 6、超净工作台內的酒精有机溶剂及易燃物（如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要远离火苗，不可留置火焰燃烧，万一着火，应力持镇定，沉着处理。酒精或乙醚等着火时，应使用泡沫灭火剂或湿毛巾覆盖，勿使用水冲洗。 7、使用震荡器震荡培养时，注意三角瓶务必对称放置，并用橡皮筋等夹紧，勿使其摇晃摔出台面
7、，否则需拆开并清除玻璃碎片与培养液。 急救措施1、急性呼吸系统中毒：应使中毒者迅速离开现场，移到通风良好的地方，呼吸新鲜空气。如有休克、虚脱或心肺机能不全，必须先作抗休克处理，如人工呼吸、给予氧气、喝兴奋剂（如浓茶，咖啡）等。2、经由口服而中毒：需立即用3-5%小苏打溶液或1：5000高锰酸钾溶液洗胃，洗胃时要大量地喝，边喝边使之呕吐，最简单的催吐办法是用手指或筷子压舌根，或给中毒者喝少量（15-25毫升）1%硫酸铜或硫酸锌溶液（催吐剂）。使之迅速将毒物吐出。洗胃要反复进行多次，直至吐出物中基本无毒物为止。再服解毒剂，一般解毒剂有鸡蛋清、牛奶、淀粉糊、桔子汁等。另外有些特殊解毒剂专对某种中毒而
8、用。如磷中毒时用硫酸铜，钡中毒时用硫酸钠，氰化物中毒时用硫代硫酸钠等。3、皮肤、眼、鼻、咽喉受毒物侵害时，应立即用大量自来水冲洗，然后送医院请各专科医生处理。4、一度烧伤：只损伤表皮，皮肤呈红斑，微痛，微肿，无水泡。如被化学药品烧伤，应立即用大量水冲洗，除去残留在创面上的化学物质，并用冷水浸沐伤处，可减轻疼痛，最后需要消毒，保护创面不受感染。 5、二度烧伤：损伤表皮及真皮层，皮肤起水泡，疼痛，水肿明显。创面如污染严重，先用清水或生理盐水冲洗，再以1：1000新洁尔灭消毒，不要挑破水泡，用消毒纱布轻轻包扎好，请医生治疗。 6、三度烧伤：损伤皮肤全层，包括皮下组织，肌肉，骨骼，创面呈灰白色或焦黄色
9、，无水泡，不痛，感觉消失。在送医院前，主要防止感染和休克，可用消毒纱布轻轻包扎好，给伤者保暖和供氧，必要时注射吗啡止痛。7、炸伤：其急救措施基本同烧伤处理。但炸伤后伤口往往大量出血，应立即将伤口上部扎紧，防止流血过多。如发生昏迷、休克等，应进行人工呼吸，给氧，并送医院治疗。8、电击伤：急救时首先使触电者脱离电源，为此可拉下电闸或用木棍将触电者从电源上拨开。当心别把触电者摔伤。断开电源后，检查伤员呼吸和心跳情况，若呼吸停止，立即进行人工呼吸。对心跳亦停止者要同时进行心脏挤压。电击伤比较轻微者，很快能恢复健康，重者必需请医生治疗。应该注意，触电者在进行急救时，一般不要注射强心针和喝兴奋剂。实验操作
10、须知1、实验室设计与要求 实验室设计是由工作的目的和规模决定的，要合理布局，通常按自然工作程序先后安排成一条连续的生产线，避免有的环节倒排增加日后工作的负担或引起混乱。房屋可规划为洗涤室、灭菌室、配制室、无菌操作室、培养室、鉴定室、驯化移栽室等。1. 1准备室 需备有的设备有：鼓风干燥箱、落水架、工作台、水池、水桶、水盆、试管刷等，主要用于玻璃器皿、用具和培养材料清洗；还需要有高压水龙头用于冲洗。1.2灭菌室需备有高压蒸汽灭菌装置、细菌过滤器、用于培养基及培养器械的灭菌。1.3配制室 需备有冰箱、化学实验台、药品柜、器械柜、物品存放架以及各种玻璃器皿和用具，包括各种不同容积的容量瓶、烧杯、量筒
11、、移液管、三角瓶、磨口瓶、广口瓶、各种类型培养瓶、玻璃棒、移液管架、试管刷、电炉、微波炉等。1.4无菌操作室(接种室) 无菌操作室在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精细密闭，忌粗陋放散，是植物组织培养研究或生产工作中最关键的部分，关系到培养物的污染率，接种工作效率等重要指标。要求如下:(1)地面、天花板及四壁尽可能光洁、避免积染灰尘，易于采取各种清洁措施。 (2)干爽、安静、清洁明亮，在适当的位置吊装紫外灯1-2盏，用以经常照射灭菌，使室内保持良好的无菌、低密度有菌状态。 (3)最好安置一小型空调机，使室内温度保持在26左右，这样就可以在工作时或不工作时都把工作室的门窗紧闭，保持与外界相对隔绝
12、的状态，尽量减少与外界的空气对流，减少尘埃与微生物侵入。 (4)经常采用消毒措施，达到较高的无菌水平，以利完全操作提高工作的质量与效率。 (5)无菌室外应留有缓冲间，进入无菌室前在此更衣换鞋洗手及处理外界采回准备消毒培养的材料等。无菌操作室应备有超净工作台或接种箱、固定式载物台、移动式载物台、广口瓶、酒精灯、纱布、器械支架、手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等。1.5培养室应尽量安排在楼层较高处，以利于采光，减少尘埃和杂菌污染的机会。此外应考虑清洁、干燥，培养室保温隔热。培养室中距离窗户较远处的培养架应适当安装人工辅助照明的日光灯。应设计能有效通风的窗户、定期或需要时加强通风散热，如在室内地板稍高处
13、设置进风气窗，在气窗的对侧近天花板设置排风窗，也可安装小功率的排风扇。室内应备有制冷设备、加热设备、控光设备、固定式培养架、旋转式培养架、摇床等。1.6鉴定室需备有高倍显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、解剖镜、恒温箱、切片机、烤片台、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。1.7驯化移植室 应备有温室、弥雾装置、荫棚、移植床、钵、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗沙等，用于试管小植株的锻炼和移植。2、操作前的准备工作接种室在接种前4-5 d必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全面消毒，一般用40%福尔马林进行全面喷雾，并密闭24 h，然后打开换气窗10-15 min.。 接种前1 h打开超净工作台和
14、棚面的紫外灯照射30 min。 杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后体息时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。不可穿工作服离开接种室，接种期间两边的门切记要关闭。3、准备进台进入接种室前，应先将手表、手镯、戒子、耳环等放在室外，将手和手腕用肥皂洗净后才能进入接种室，并用75%酒精纱布擦拭双手、双腕(此纱布置于超净工作台外烧杯内，并适时注入酒精)之后换上消毒的工作服、帽子、口罩(盖上鼻子和嘴、着装时注意头发不得置于帽子外，袖口用皮筋扎紧)，进入台内。 操作前用台内的酒精棉团擦
15、拭手、手腕，再擦培养基和超净工作台，一般按如下顺序擦拭培养瓶：瓶的棉塞、瓶身、瓶底，彻底擦拭后放入超净工作台。4、接种操作 4.1、剪、镊消毒 每次取出时剪口并拢，不可接触磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下;剪、镊分别在酒精灯外焰彻底灼烧，烧时将剪口镊口张开，烧至剪、镊上部，火焰熄灭后，插回磨口瓶。4.2、用上述消毒过的器械，将切割好的外植体插植到培养基表面上，具体操作是： (1)左手拿三角瓶，解开包头纸，将三角瓶几乎水平拿着，靠近酒精灯焰，将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟，使瓶口的水气散发掉。 (2)右手小指和无名指配合手掌将棉塞在灯焰附近慢慢拔出，以免空气速向瓶内冲击，引起瓶口灰尘等冲入，造成污染
16、。 (3)棉塞始终夹在右手两手指之间，这时再将瓶口在灯焰上旋转，使充分灼烧灭菌。 (4)用右手大、食、中指拿镊子夹一块外植体送入瓶内轻轻的插入培养基中，镊子灼烧后放回磨口瓶，再把棉塞在灯焰上灼燎数秒，灼燎时应旋转，避免烧坏，塞好棉塞，包上报纸，便完成了第一瓶的操作，接着再做第二瓶，如此直到外植体全部接完。 操作中必须遵守的事项：（1）棉塞不能乱放。手拿的部分限于棉塞膨大的上半部分，塞入瓶口的那一段始终悬空，并不要碰到其它任何物体；若是螺旋盖或薄膜，则应解下放置在灭过菌的台面上，放置处应随时用酒精棉团涂抹灭菌。（2）操作人员的头、胳膊等不得进入台内。 （3）操作人员不得随意谈话、说笑，以免造成污
17、染。 （4）台外人员走动要轻、动作要小。 （5）接种完毕后注意标明接种材料名称、日期、处理。5、培养器材的清洗在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物质仅0.01g/L就会对细胞产生毒性作用，因此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重要的环节。5.1、玻璃器皿浸泡 初次使用和培养后的玻璃器皿都需用水浸泡。新用的玻璃器皿，常带有许多干涸在上面的灰尘，同时又由于生产的原因，常呈碱性并带有一些对细胞有毒性的物质，如铅和砷等。在使用前要经稀盐酸（5%）浸泡，中和其中的碱性物质便于清洗。用过的玻璃器皿往往带有大量蛋白质附着，
18、干涸后不易刷洗掉，故用后要立即用清水浸泡。刷洗 浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗去玻璃器皿上的杂质。刷洗次数太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以宜选用软毛刷和优质的洗涤剂。禁用去污粉，因其含有沙粒，会严重破坏玻璃器皿的光洁。酸洗 刷洗不掉的极微量杂质经过洗液的强氧化作用可被除掉。洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分有效，是清洗过程中最关键的一环。洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成，浸泡时，器皿要充满洗液。常用的洗液配方见附表一。冲洗 刷洗和洗液浸泡后都必须用水充分冲洗，不留任何残迹，然后用蒸馏水漂洗23次，凉干备用。5.2 塑料器皿塑料器皿耐腐蚀能力
19、强，但质地较软，且不耐热，因此它和玻璃器皿清洗不同。通常的方法是：先用清水充分浸泡和冲洗；再用2%NaOH溶液浸泡过夜，自来水冲洗，然后用5%稀盐酸浸泡30分钟，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水漂洗3次，晾干备用。5.3 滤器玻璃滤器与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是酸浸，都可用抽滤法。1） 使用后，立即将清水注入滤器，抽气过滤，反复抽滤5次。2） 干净铬硫酸洗液或热浓硫酸注入滤器，抽气过滤至酸液滤过完毕。3） 用清水再次抽滤10次。4） 蒸馏水抽气过滤3次。蔡氏滤器使用后弃去石棉滤膜，金属部分刷洗干净，最后用蒸馏水漂洗23次，晾干备用。新购置的胶塞带有大量滑石粉，先用自来水冲洗干净，常规处理，每
20、次用后的胶塞用水浸泡，然后用2%NaOH煮沸15min左右，自来水冲洗，再用1%稀盐酸浸泡30min，最后用自来水冲洗和蒸馏水漂洗，晾干后备用。实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。二、实验器材 电光分析天平（感量为0.0001g）、扭力天平（感量为0.01g）、台秤（感量0.5g）、烧杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（1000ml、100 ml、50 ml、25
21、 ml）、细口瓶（1000 ml、100 ml、50 ml、25 ml）、药勺、玻璃棒、电炉。三、实验药品NH4NO3、KNO3、CaCl22H2O、MgSO47H2O、KH2PO4、KI、 H3BO3、 MnSO44H2O、 ZnSO47H2O、 Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O、FeSO47H2O、Na2-EDTA2H2O、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸。四、实验步骤1、大量元素母液的配制各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍，用感量为0.01g的扭力天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000
22、ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。 表1 MS培养基大量元素母液制备序号药品名称培养基浓度（mg/L）扩大10称量(mg)1NH4NO3165016500蒸馏水定容至1000ml2KNO31900190003CaCl22H2O44044004MgSO47H2O37037005KH2PO41701700注意：(1) 配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯
23、，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。(2)CaCl22H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl22H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。、微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe）组成。微量元素用量较少，特别是CuSO45H2O、CoCl26H2O，因此在配制中分微量、配制。按照表2，表3配方，用感量为0.0001g的电光分析天平称量，其它同大量元素。配制培
24、养基时，每配制1L培养基，取微量10ml，微量ml表2 MS培养基微量的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍称量(mg)1MnSO44H2O22.322302ZnSO47H2O8.68603H3BO36.26204KI0.83835Na2MoO42H2O02525表3 MS培养基微量的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大1000倍称量(mg)1CuSO45H2O0.025252CoCl26H2O0.02525注意：使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素
25、一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制1L取此液10ml。表4 MS铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大100倍称量(mg)1Na2-EDTA 37.337302FeSO47H2O27.82780注意：在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热
26、搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。4、有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。注意：由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。避免此现象发生的方法是:配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。表5 MS培养基有机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大倍数称量(mg)配制体积
27、(L)1甘氨酸25001000.12肌醇10020020000.13盐酸硫胺素(VB1)0.41000400.14盐酸吡哆素(VB6)0.51000500.15烟酸0.51000500.15、 激素母液配制植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：（）配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。（）细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加34滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。（
28、）配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。注意：所有的母液都应保存在04冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。五、思考题：1、 配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl22H2O时，为什么要将蒸馏水加热？2、 根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。培养基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。表6 按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表药品名称母液浓度1L培养基母液吸取量0.3L培养基母液吸取量大量元素10倍液微量元素100倍液微量元素1000倍液铁盐100倍液VB10.4mg/mlVB
29、60.5mg/ml烟酸0.5mg/mlGly1mg/ml肌醇20mg/mlBA0.5mg/mlKT0.5mg/mlNAA0.5mg/ml蔗糖琼脂PH值5.8实验二 培养基的配制与灭菌一、实验目的与意义学习培养基配制与灭菌的操作方法。对植物外植体进行离体培养时，要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的要求不同，适当的设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控，次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的。培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等。二、实验器材天平、烧杯（1000ml）、医用瓷缸（1
30、000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网。三、实验药品蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、HCl、各种培养基母液。四、实验步骤（一） 培养基配制（以1L MS培养基为例）1、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量 ml=培养基中物质的含量（mg/L）1000ml/母液浓度（mg/L）。2、移液取医用瓷缸一只，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。注意：在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重
31、新进行配制。用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错；移液管不能混用。3、称取称取8g琼脂，30g蔗糖备用4、融化用搪瓷量杯量取600700ml的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。注意：在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。5、混合将融化的琼脂和母液充分
32、混合，用蒸馏水定容到1000ml，来回混合几次。6、调pH用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.47.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.20.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.20.5个单位左右)。注意：调至时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。7、分装溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml或100 ml)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥
33、形瓶容量的1/51/4。每1L培养基，可分装2530瓶。8、包扎用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。注意：培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。避免此现象发生的方法是:调整培养基pH值，一般不低于5.6，若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量。（二）培养基的灭菌培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养
34、中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。1、高压蒸汽灭菌法把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水，水位高度不超过支架高度。盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。加热后，锅上压力表指针开始移动，当指针移至0.5kg/cm2时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。当指针移至1.11.2kg/cm2时，即121时，维持一定的时间。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑，具体可以参考表1。灭菌后要趁热取出三角瓶，不可久不放汽，让压力锅自行冷却，这样易将棉塞等闷得太湿，引起后来长霉污染。培养基自然冷却凝
35、固。放置1 d后再使用。表1 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间容器的体积(ml)在121下最少灭菌时间(min)205015751502025050025100030150035200040注意：（1）锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。对蒸馏水，各种器具灭菌时，灭菌时间要适当延长，压力也要提高，一般在126维持一个小时。另外三角瓶中的液体不超过总体积的70%，否则当温度超过100时，
36、培养基会喷溢，造成培养瓶壁和封口膜的污染。（2）消毒后的培养基不能立即用于接种，而应放置24-72h。放置后如果培养基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接种。另外做好的培养基一般应在1-2周内用完，短时间可存放于室温条件，如不能尽快用完，应放在4条件下。表2 饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力kg/cm2 磅/平方英寸 温度饱和蒸汽压力kg/cm2 磅/平方英寸 温度0.001001.05515121.00.1412103.61.12516122.00.2814106.91.26618124.10.4426109.81.40620126.00.5638112.61.54322
37、127.80.70310115.21.68124129.60.84412117.630134.50.98414119.950147.62、过滤除菌培养基中某些成分是热不稳定的，在高温湿热灭菌中可能会降解。这类物质需要进行过滤灭菌。例如一些生长因子，如赤霉素(GA)、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至40,再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入,摇匀,凝固后即可使用。如果是液体培养基，没有凝固这个问题，则可在冷却到室温后再加入。 除菌滤膜其孔径尺寸一般要小于或等于0.4m
38、。过滤灭菌的原理，是溶液通过滤膜时，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。滤膜的吸附作用力也不容忽视，往往小于滤膜孔径的细菌等亦不能透过。在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置。液量少时可用注射过滤器，它由注射器、滤器(可更换)、持着部分和针管等几部分组成。注射器不必先经高压灭菌，而后面几部分要预先用铝箔或牛皮纸等包扎好，最好放在有螺旋盖的玻璃罐中，经高压灭菌，滤器灭菌不应超过121。由于这个“注射过滤灭菌器”小巧、方便、实用，在液量多时多用几套这种装置(亦可适当重复使用)也能顺利完成液体灭菌操作。在使用前按无菌操作要求将注射过滤灭菌器的几个部分装配在一起，把吸有需要过滤灭菌溶液的注射器
39、插入细菌过滤器与之相配合的插接口，推压注射器活塞杆，将溶液压过滤膜，从针管部分滴出的溶液就是无菌溶液了，但是滤膜不能阻挡病毒粒子通过。在一般情况下，人工配制的溶液不会含有使植物致病的病毒。更严格的实验研究中，这一点仍不容忽视。毫无疑问，过滤过的溶液要按无菌操作要求尽快加入培养基中，以免重新遭到污染。假如需经过滤灭菌的溶液带有沉淀物，那么在过滤灭菌之前可用3号烧结玻璃滤器预先予以去除，这样可以减少细菌滤膜微孔被堵塞的情况。实验三 培养材料灭菌和接种一、实验目的与意义培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要的环节。通过本实验，领会无菌培养对实验材料消毒，接种的要求，初步掌握培养材料灭菌，接种的
40、操作技术。二、实验器材超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。三、实验药品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根，绿豆种子、培养基母液。四、实验步骤（1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。（2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少25分钟，然后关室内的紫外灯，开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风十分钟后，再开日光灯进行无菌操作。（3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。（4）将绿豆种子在流水下冲洗干净。（5）将种子放于200ml的广口瓶中，用7
41、5%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗，然后用0.1%升汞溶液（加入吐温2滴）浸泡3、5、10min，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。（6）解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。（7）接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。（8）在酒精灯火焰旁揭去封口膜，将瓶口倾斜接近水平方向，用火焰灼烧瓶口，灼烧时应不断转动瓶口（靠手腕的动作，使试管口沾染的少量菌得以烧死），左手持瓶，使其靠近火焰，右手将烧过的镊
42、子触动培养基部分，使其冷却，夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放4-6个外植体。（9）转动瓶口灼烧，将封口膜从酒精灯火焰上过一下，盖上封口膜，扎好绳子，标上接种日期、材料名称、姓名等。（10）将接种材料移到培养室培养。注意：（1）从室外取得材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。（2）外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素,最好选用两种消毒剂交替浸泡,初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂的见表1。（3）工作台
43、接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打喷嚏），以免影响气流，造成污染。另外操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。（4）接种前培养基出现大量污染现象,若菌类只存在于培养基表面，且主要是真菌时，可能是因培养瓶密封不严或放置培养基的环境不洁净，菌类种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，则可能是由使用污染的贮藏母液引起。另外培养瓶不洁净，灭菌不彻底也是导致接种前培养基污染的原因。避免此现象发生的方法是:保持环境洁净，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序，保证灭菌时间。（5）接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀,此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌
44、类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等原因引起。避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20-30 min；用75%酒精喷雾杀菌降尘，超净台开启15-20 min后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，且接种时使用1次灭菌1次；操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。（6）接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-1 5 min，自来水冲洗0 .5-2h后，再选择适宜的灭菌剂消毒，一般用0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。表1 植物组织培养中常用的消毒剂消毒剂名称使用浓度（%）消毒难易灭菌时间（min）消毒效果乙醇7075易0.13好氯化汞0.10.2较难215最好漂白粉饱和溶液易530很好次氯酸钙910易530很好次氯酸钠2易530很好过氧化氢1012最易515好五、思考题1、接种后污染调查观察接种后25天的污染情况，填入下表：观察日期接种日期接种数污染数污染率主要污染菌种
