园艺植物组织培养第6章ppt课件.ppt

《园艺植物组织培养第6章ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《园艺植物组织培养第6章ppt课件.ppt（92页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第六章 花药和花粉培养,花药和花粉培养的研究概况,花药和花粉培养的主要内容,花药培养方法,花粉植株的诱导,单倍体植株的二倍体化,第一节 花药和花粉培养的研究概况,花药或花粉培养的目的 是为了获得单倍体植株,所谓单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子体。,植物体内的单倍体细胞：,小孢子,大孢子,其它自然突变产生的单倍体细胞,花药或花粉培养的意义,一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种, 缩短育种年限和提高育种效率;,二是用所获得的纯合二倍体材料进行遗传变异规律研究, 使园艺植物育种有坚实的遗传理论依据, 减少育种的盲目性;,三是利用在远缘杂交F1 代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料

2、进行园艺植物细胞遗传学等基础性研究;,四是有利于新抗源的不断发现和野生资源的充分利用。,另外, 在分子生物技术迅速发展和日趋成熟的今天, 花药培养的应用领域不断扩大, 其研究意义日益突出。,园艺植物的花药培养始于20 世纪70 年代, 随着技术的成熟, 研究的深入, 目前在许多园艺植物上已获得成功,如柑橘、苹果、李、扁桃、荔枝 、枇杷、黄瓜、芦笋、番茄、西瓜、辣椒和花椰菜等。,第二节 花药培养的方法,（1）取材,取花粉发育到一定时期的花药进行培养。,一般而言，单核后期花药对培养反应较好。,因此，花药在接种以前，必须确定花粉的发育时期。,2.1培养方法,.四分孢子,单核中期，细胞质液泡化，核逐渐

3、移向细胞边缘；,单核晚期，中央液泡形成，核移到和萌发孔相对的一边,花粉第一次有丝分裂中期；,.单核早期，核居中，细胞质没有液泡化,小孢子发育过程图解,双核初期，两核等大；,三核期，生殖核分裂成2个精子，营养核开始退化；,双核晚期，生殖细胞移到花粉中央,双核中期，两核形态上分化为营养核（上）和生殖核（下）,三核成熟花粉,一般用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。根据这些体征确定花粉的发育时期。,但这种相关性不是一成不变的，而会因品种和气候的不同而异，因此，在实验中还必须由每个花蕾取出一个花药，通过镜检确定花粉发育的准确

4、时期,（2）预处理,目的是提高花粉的诱导率。,预处理的方式：,低温预处理、,离心处理、,高温预处理、,和预培养等,目的：,就是从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，以改变其分裂方式和发育途径。,对于不同的种类、品种和生理状态的花药培养所要求的预处理及其作用也不同。,在甜( 辣) 椒上, 低温处理一般采用47 , 处理12 h10 d。,李玉花等以高压静电场处理番茄花药后接种于培养基上, 发现高压静电场处理花药可显著提高愈伤组织诱导率, 而且静电场处理后可使组培茎丛苗超氧化物歧化酶( SOD) 活性升高, 丙二醛( MDA) 含量降低。,（3）消毒,花药适宜培养时，花蕾尚未开放

5、，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态，因此，通常只要以70酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。,（4）接种,由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。,在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。,如果所碰到的是花器很小的植物，可借助解剖镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。,在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花

6、粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上孢子体组织增殖的机会很少。不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。,（5）培养方式,花药的培养方式主要有3种：,一是在琼脂固化培养基表面培养，,二是在加人30Ficoll的液体培养基表面飘浮培养，,三是利用固体液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。,（6）培养条件,温度,花药对培养温度的要求因物种而不同， 对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6 d以30-32 的较高温度，然后再转入28-30

7、 下培养，花药出愈率会有明显提高。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27 。,光照,对光照的要求在物种间差异更为明显例如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。,愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和照光时间的要求则因物种而异。例如水稻花粉愈伤组织在转人分化培养基之初仍不宜照光培养，须待35 d后再给以每天14 h 1 0002 000 lx的光照，以免引起愈伤组织的老化坏死。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。,（7）花粉植株的诱导,烟草花药接种在无激素培养基

8、上1周以后，即有部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断分裂，相继形成球形胚、心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体，见光后变绿，并逐渐长成小苗。每个花药中长出的小苗数可从1株到几十株不等，最多者可达180株以上。,禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。,第一步，将花药接种在含有2,4-D(12 mg/L)的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。,第二步，当花粉愈伤组织形成后1015 d，其直径已长到1.52.0 mm时，及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化。分化培养基中不含2, 4-D，含有NAA和KT各0

9、.5 mg/L。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根。,注意： 在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。 在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。,（8）壮苗和移栽,以小麦为例，王培等采用的方法是：将已长出23片叶的花粉植株转人含有多效唑3 mg/L，NAA和KT各0.5 mg/L，LH 500 mg/L和蔗糖8的MS养基上，于2225下进行壮苗培养然后在38低温弱光条件下越夏，深秋时炼苗移栽。,2.2 影响雄核发育的因子,所谓雄核发育（androgenesis），指的是小孢子沿孢子体途

10、径发育成花粉植株的过程。,影响雄核发育的因子很多，除上节提到的以外，还包括以下5个方面 ：,孢子体：在世代交替的生活史中，产生孢子和具二倍体染色体的植物体。配子体：在世代交替的生活史中，产生配子和具单倍体染色体的植物体。世代交替：指的是在生物的生活史中，产生孢子的孢子体世代（无性世代）与产生配子的配子体世代（有性世代）有规律地交替出现的现象。,1. 基因型,基因型是影响花药离体培养反应的关键因子之一。,不同基因型植株的花药对培养的反应不同, 表现在花药培养力如愈伤组织诱导率、分化率、胚状体诱导率及植株诱导率不同等, 有些材料对某些培养基没有反应。,陈肖师对17个甜椒品种进行花药培养, 胚状体诱

11、导率为0.3%6.8%不等。,Dumas 等发现较大果型的灯笼椒花药培养效果较好, 产生胚状体花药所占比率为5 %40 %。,张恩让等对花溪辣椒和青岩辣椒进行花药培养, 出胚率分别为1.83 %和1.29 %。,侯喜林在对草莓花药进行离体培养时观察到，女峰的愈伤组织多为绿色或黄绿色，宝交早生的愈伤组织则多呈黄白色或红色( 少量为黄绿色) ，而丰香的大部分愈伤组织是褐色的。,在不同品种的百合中, 诱导率从019.26 %不等。,研究表明, 花药培养力的大小, 是受多基因控制的数量性状, 因而随着基因型的差异而有很大变化。,2. 生理状态,在开花末季采集的花药不但形成孢子体的频率很低，而且发生反应

12、的时间也较迟。,供体植株的年龄及其所处的生长条件也能影响花药对离体培养的反应，一般来说，幼年植株的花药反应能力较好。,在水稻和小麦等禾谷类植物中，大田植株比温室植株、主茎穗比分孽穗花粉愈伤组织的诱导率高。,在烟草中，当光照强度相同时，由生长在短日照(8 h)条件下的植株上采集的花药，要比在长日照（16 h）条件下采集的对培养的反应高出60。,由供体植株生长条件的差异造成的花药对培养反应的不同，可能是内生激素水平变动的结果。王敬驹等（1974）看到，在水稻中若在10下用乙烯利预处理植株84 h，可增加花药对培养的反应能力。,3. 花粉发育时期,在诱导花粉进行雄核发育的过程中，花粉在接种时所处的发

13、育时期可能比培养基成分更为重要。,虽然说，一般情况下单核后期花药对培养反应较好，但不同物种最适的发育时期不同。,如在杂配芍药（Paeonia hybrida )中，最适时期是在花粉第一次有丝分裂的当时或稍前稍后。而在颠茄和林生烟草中以双细胞早期最好，很多禾本科植物的花药是在单核早期（大麦）或单核中、晚期（玉米、小麦）反应最好。,检查花粉发育时期常用的方法是醋酸洋红染色，但对于DNA含量较低的材料，最好用孚尔根试剂染色。此外，对水稻和玉米等植物而言，I-KI染色效果比醋酸洋红更好。,4.药壁因子,在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用。,如把一个品种烟草的花粉移植到另一个品种的花药中，前者也能够

14、顺利地发育成胚。,花药对同一物种及不同物种离体花粉雄核发育有看护作用。,花药浸提液也能刺激花粉胚的形成。,组织学研究也证实药壁在花粉胚发育中的作用。,在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒，才能顺利发育成花粉胚。,在天仙子中，也只有处在药室外围紧靠绒毡层的花粉能够成胚。,这些事实表明，由绒毡层起源的某些重要物质的梯度变化，对于诱导花粉粒发育成胚起着关键的作用。,5.培养基,（1）基本培养基,基本培养基对花药培养的成败影响很大。花药培养研究证实MS，Miller和Nitsch培养基等对花药培养的普遍适用性。另外，又设计了几种新的配方，如适用于稻、麦和玉米的N6培养基，适用于小麦的C17培养基，W

15、14培养基和马铃薯-2培养基，从而提高了这些禾谷类植物花粉形成愈伤组织的频率和愈伤组织分化绿苗的频率。,和MS培养基相比，N6，C17和W14的一个共同特点是，大幅度降低了其中氨离子浓度，并调整了其中氨态氮和硝态氮的比率：在N6培养基中，NH4离子浓度由MS中的20.62 mmol/L降至7.01 mmol/L，氨态氮与硝态氮的比值由MS中的0.52降为0.25。,（2）碳源,在花药培养中，蔗糖一直是最常用的碳源。,其他糖类，如麦芽糖、果糖和葡萄糖等做碳源，也可取得了良好的培养效果。,例如，据朱至清等在过滤灭菌的条件下，以0.21 mol/L葡萄糖取代液体培养基中等摩尔浓度蔗糖，小麦花粉胚的诱

16、导频率可增加210倍。当把这些花粉胚转到含有0.21 mol/L葡萄糖但无2,4-D的双层分化培养基（过滤灭菌）上以后，其中40%90长成了试管苗；而在含有蔗糖的培养基中，只有0一30能够成苗。,另外，蔗糖在培养基中还起着调节渗透压的重要作用。 所用的蔗糖浓度最好能在不妨碍花粉细胞增殖的同时，又能抑制体细胞的增殖。,花药培养中采用的蔗糖浓度通常是：甜椒和柑橘等3%，水稻36，小麦610，大麦和黑麦草12，玉米1215。,（3）植物激素,雄核发育的途径是直接形成花粉胚。在这些植物中，一般不需要激素，在基本培养基上就可以产生完整的单倍体植株，在有些情况下，甚至连维生素也无必要。例如烟草、曼陀罗等。

17、,培养基中的激素成分对于诱导花粉细胞的增殖和发育起着重要作用。,由于植物种类不同，花药在离体培养中对激素的要求有2种不同的情况：,花粉粒首先形成愈伤组织，然后，或是在同一培养基中，或是在略加改变的培养基中，由愈伤组织分化出孢子体。在这些植物中，如非茄科物种中，为了诱导花药进行雄核发育，必须单独地或以不同配比在培养基中加入生长调节物质、复杂的营养混合物（如酵母浸出液，水解酪蛋白）和椰子汁等。,如在大多数禾本科植物如水稻、小麦、大麦和黑麦的花药培养中，外源生长素，特别是2,4-D(13 mg/L)，是启动小孢子细胞分裂形成愈伤组织的必要条件。但燕麦和玉米例外，它们的花药在没有外源激素刺激的情况下，

18、即能启动细胞分裂。在水稻和小麦花药培养基中除2,4-D之外还常常添加KT 0.5 mg/L，其作用或在于增强愈伤组织的胚胎发生能力，或在于抑制花丝愈伤组织的形成。,有时，通过审慎地改变培养基中的生长调节物质，有可能改变雄核发育的方式。例如在小麦中，如果培养基里含有2,4-D和水解乳蛋白，花粉就形成愈伤组织；如果在基本培养基中补加椰子汁，花粉粒就直接发育成胚。,（4）活性炭,在花药培养中，有些报告表明活性炭对雄核发育具有促进作用。例如在马铃薯花药培养基中添加0.5活性炭，能大幅度提高花粉植株的形成频率。但是有些作者却指出，这种效应可能与这类茄科植物的雄核发育不依赖于外源激素有关，对于必须依赖外源

19、激素才能进行雄核发育的植物来说，在花粉愈伤组织诱导培养基中添加活性炭可能是有害而无益的。,2.3 雄核发育单倍体的个体发生过程,1. 花粉单倍体的诱导,对于大多数物种来说，适于诱导雄核发育的花粉发育时期，是在单核小孢子第1次有丝分裂即将开始、正在进行、或刚刚结束的时候。,2.雄核发育早期过程的4种途径,第1种途径：单核小孢子进行一次均等分裂，形成两个等同的子细胞，而不是形成相互有别的营养细胞和生殖细胞。两个等同的子细胞都参与孢子体的发育。这种途径在毛曼陀罗中相当普遍。,根据小孢子最初几次分裂的方式，可将离体条件下雄核发育的途径分为以下4种：,第2种途径：单核小孢子先进行一次正常的非均等分裂，然

20、后通过营养细胞的进一步分裂形成孢子体。生殖细胞或者完全不再分裂，或者分裂1一2次后即行退化。这种发育途径在辣椒中都普遍存在。,第3种途径：在天仙子中，花粉胚主要是由生殖细胞单独形成的，营养细胞或是完全不再分裂，或只分裂有限几次即停止。无论在哪种情况下，营养细胞最终都变成一个类似胚柄的结构，附着在由生殖细胞起源的胚的胚根一端。,第4种途径：如在第2种途径中一样，形成一个营养细胞和一个生殖细胞。但在这种情况下，2个细胞都进一步分裂并参与孢子体的形成。这种雄核发育途径迄今还只见于毛曼陀罗中。,3. 雄核发育晚期过程的差异,雄核分裂变成了一个多细胞的花粉粒。当把花粉壁撑破以后，释放出来的是一团轮廓不规

21、则的组织。这团组织有两个发育方向：,方向一 逐渐变成了一个球形胚，球形期进一步发育到心形、鱼雷形、直到子叶期，如颠茄、曼陀罗、天仙子和烟草等植物。通过这个途径，一个花粉粒只形成一个植株。,方向二 形成愈伤组织，以后在同一种或另一种培养基上，由愈伤组织分化产生植株。,在有些植物如水稻、天仙子中，通过改变培养基的成分可以控制花粉植株的产生方式经由胚状体或经由愈伤组织。,禾谷类植物花药培养中白化苗的形成,在禾谷类植物花粉单倍体生产中存在一个严重问题是出现大量的白化苗。在大麦、小麦和水稻的花粉植株中，白化苗通常占总苗数的1/3以上，严重的情况下，例如在大麦品种Sabarlis的花粉植株中白化苗频率高达

22、60-90%，这大大限制了花药培养技术在育种实践中的应用。,在水稻中造成白化的原因是由于前质体不能正常发育成叶绿体，既不能形成基粒又完全缺乏核糖体，改变培养基成分也无助于这个问题的解决。现在只知道白化苗的形成受温度的影响。当温度有26 增加到35 时，白化苗的数目也随之增加。,在水稻上还观察到：花粉处于单核期的花药若在10 和13 下冷处理3-14 d，所产生的植株中有90%是绿苗，10%是白化苗。然而，无论在上述那种温度下，若把冷处理的时间延长到21d，所产生的植株几乎全是白化苗。同时还注意到，花粉处在双核期的花药比处在单核期的花药产生的白化苗较多。除葡萄外，在禾本科以外植物的花药培养中未曾

23、发现过白化苗。,3.1 花粉培养与花药培养的比较,花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。小孢子培养与花药培养的区别见图6-7。,第三节 花粉培养,图6-7花药培养与花粉培养的比较,Ld-lg为器官发生途径产生单倍体；,2d-2e为胚胎发生产生单倍体；,3b-3f为花粉培养产生单倍体过程,小孢子培养的优越性：,花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小孢子启动第一次分裂，小孢子培养则不存在这一问题；,花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株；,由于起

24、始材料是小孢子获得的材料总是纯合的，不管它是二倍体还是三倍体；,小孢子培养可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，是一个很好的遗传与发育研究的材料体系；,由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料。,3.2 分离花粉的方法,1. 自然释放法,有些物种的花蕾消毒后，无菌条件下取出花药，放在液体或固体培养基上培养，花药会自然开裂，将花粉散落在培养基里（上），然后将花药壁去除，进行花粉培养。但这种方法由于效率低，一般不采用。,2. 研磨过滤收集法,这种方法只在茄科植物和油菜上成功地应用。将花蕾消毒后，放人含培养基或分离液的无菌研磨器中研磨，使花粉（小孢子）释放出

25、来，然后通过一定孔径的网筛过滤，离心收集花粉并用培养基或分离液洗涤，然后用培养基将花粉调整到理想的培养密度，移人培养皿培养。油菜小孢子分离技术程序如下：,首先根据花蕾大小判断小孢子的发育时期;,取合适的花蕾于6的次氯酸钠中，在摇床上摇动，表面消毒15min，然后用无菌水冲洗3次，每次5 min。,取5075个花蕾在5 mL培养基（含13蔗糖）里研磨成匀浆，,然后通过44 pm尼龙网过滤到1个50 mL离心管中，研磨烧杯和网上匀浆用培养基冲洗3次，每次用培养基5 mL。,收集的小孢子悬浮液于1900一1950 r/min离心3 min，去掉上清液，用5mL新鲜培养基悬起沉淀物，重复2次，用培养基

26、调整到理想密度进行培养。,3. 剖裂释放法,这一技术需要借助一定工具剖裂药壁，使花粉或愈伤组织，或胚释放出来，这种方法最早在烟草里尝试，后来在Pennisetum typhoides上成功应用。显然，这种方法比自然释放法费时。,3.2 花粉（小孢子）培养方法,这一方法类似于原生质体培养，分离的小孢子经洗涤纯化后，调整到需要的浓度，根据培养皿的大小，适量加入培养液培养（培养液厚1mm左右）。待愈伤组织或胚状体形成后转移到分化或胚发育的培养基上生长。,1. 液体浅层培养,2. 平板培养法,分离的花粉在平板培养基上培养，也可诱导产生胚状体，并进而分化成小植株。,3. 看护培养法,将滤纸片放置在完整花

27、药的上面，将花粉放置在滤纸片上。花粉在看护培养基上植板率可达到60。,4.微室悬滴培养法,其方法是把花药取下，表面消毒后用塑料薄膜包好，静置一夜，待花药裂开、花粉散出，制成每滴含有5080粒的花粉悬浮培养基，然后进行悬滴培养，培养方法类似于原生质体培养。,5.条件培养法,在合成培养基中加入失活的花药提取物，然后接入花粉进行培养。,首先将花药接种在合适的培养基上培养一定时间（如1周），然后将这些花药取出浸泡在沸水中杀死细胞，用研钵研碎，倒入离心管离心，上清液即为花药提取物。,提取液过滤灭菌后，加入培养基中，再接种花粉进行培养。由于失活花药的提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养成功。,第

28、四节 单倍体植株的二倍化,单倍体植株能正常地生长到开花期，但不能形成有活力的配子。为了得到有活力的配子，必须把单体植株的染色体组加倍。,在花粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低。,通过人工措施则可显著提高加倍频率。,诱导染色体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。,方法可用秋水仙素溶液浸泡，用含有秋水仙素的羊毛脂涂芽，在悬浮培养基中加入1 g/L秋水仙素 等。,处理浓度和时间因物种不同而不同。,马铃薯花药培养影响因素的研究 越恋， 何凤发1材料和方法 11试验材料 选用凉薯97、鄂马铃薯5号、康932-2、$21、7692-76等马铃薯普通栽培品种(系)，由西南大学薯类作物研究所提供，分春插和秋插

29、两季田间种植,12试验方法 121花药采集和接种 在马铃薯正常现蕾开花季节采摘花蕾光学显微镜下观察花粉发育时期，选取单核靠边期花药作为外植体将花蕾流水冲洗15 min，70酒精表面消毒30S，再用01HgCl2滴加12滴吐温消毒8min后接种在培养基上 培养基: MS+2mg/L NAA+1 mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT +30g/L蔗糖 +4.6g/L卡拉胶,122接种不同基因型花药 将供试的凉薯97、鄂马铃薯5号、康9322、$21、769276等20种不同基因型材料的花药接种在培养基上，每个三角瓶接种2030个花药接种后的材料在温度2224，白天用日光灯补充光照10h的条件

30、下培养，30d后统计诱导率花药诱导率=(愈伤组织数+胚状体数)接种花药数100,123花药不同预处理 (1)花药低温预处理 选用鄂马铃薯5号、康932-2、YA03-1，在花药接种前对该3个不同基因型的花蕾作不同时间的低温预理将大小适宜的花蕾包于双层湿纱布中，装入塑料袋于4冰箱分别预处理0 h（ ck)、24h 、48h后，再把花药接种在上述培养基上(培养基成分同121)每种处理接种57瓶，每瓶接种2030个花药，培养条件同上(同122)，30d后统计诱导率,(2)花药高温热激预培养 选用鄂马铃薯5号、康932-2、YA03-1，先取适宜大小的花药接种在培养基上(培养基成分同121），再将接种

31、有花药的三角瓶置于35黑暗条件下分别预培养0 h（ ck)，24h、48 h，然后转入122的培养条件下培养，30d后统计诱导率,124培养基添加附加物(1)添加活性炭在培养基(培养基成分同121)中分别添加03的活性炭(AC)，以不添加活性炭的培养基为对照，接种7692-76、鄂马铃薯5号、威芋3号、渝薯1号共4份材料的花药，30d后统计花药的褐化率和诱导率 花药褐化率=褐化的花药数接种花药数100,(2)添加马铃薯提取液 以凉薯97、7692-76、鄂马铃薯5号、康932-2为实验材料，接种在添加马铃薯提取液的培养基(原培成分同121)上，以不加马铃薯提取液为对照，30d后统计诱导率 5马

32、铃薯提取液的制备：将马铃薯块茎洗净后称取50 g，带皮切成碎片，加入100 mL蒸馏水，煮沸 20min，用4-6层纱布过滤静置，待沉淀后将上清液倒入1L培养基中,125花药再生植株倍性鉴定和移栽 花药再生植株在MS培养基中生长到根长05 cm时，剪取根尖进行根尖染色体数目鉴定小植株长到有5-6片叶时，切段繁殖和壮苗培养，寄栽生根，移栽至温室,2结果与分析 21不同基因型对花药诱导率的影响 接种3周后，多数花药在培养基上逐渐由绿变黄、由黄变褐，部分花药保持黄绿色或绿色有的花药外部有水滴状浸出液，有的花药体积逐渐膨大12个月后，部分花药的一端或一侧有黄色、浅黄透明或白色透明的愈伤组织冲破药壁；部

33、分花药的药室裂开，在裂口处可见浅黄色胚状体，见光后很快变绿，然后逐渐长出小植株,试验中发现，马铃薯花药培养的诱导率受基因型影响严重相同的培养条件下，不同基因型的花药诱导率具有很大差异康932-2的诱导率最高(4.17)，在接种的480个花药中产生愈伤组织或胚状体的20个；7692-76诱导率为3.75，在接种的400个花药中产生愈伤组织或胚状体的15个多数材料的花药诱导率很低，威芋3号和393077-159的诱导率分别只有0.23%，0.25%；部分材料如洋人洋，YA03-5， YA03-7无愈伤组织或胚状体形成。,22不同预处理条件对诱导率的影响 221低温预处理对花药诱导率的影响 供试的3

34、个马铃薯品种，经过不同时间的低温预处理后，其花药都能诱导出愈伤组织或胚状体，而且诱导率高于未经低温预处理的对照3个品种都是经过48 h的低温预处理效果最好康932-2低温预处理48h后诱导率可达6.15，鄂马铃薯5号和YA03-1低温预处理48 h后诱导率可分别提高到2.38，2.14,222高温热激预培养对花药诱导率的影响 高温热激预培养的结果表明，鄂马铃薯5号、康932-2、YA03-1经过24h和48 h的高温热激预培养均能诱导出愈伤组织或胚状体随着高温热激处理时间的延长，每个基因型的诱导率均提高高温热激预培养48h诱导率最高，不经过高温热激预培养的花药诱导率最低,鄂马铃薯5号不经过高温

35、热激预培养其诱导率只有1.1l，高温热激预培养48h后，诱导率为24.29，提高约22倍康932-2和YA03-1预培养，其诱导率也表现出同样增加的效果康932-2从对照0.67的诱导率提高到7.0，YA03-1的诱导率也从对照的0.5提高到7.5可见，适当的高温热激预培养可以提高马铃薯花药的诱导率在实验中还发现，经过高温热激处理后，部分花药会发黄、发褐，但这部分花药仍能诱导出愈伤组织或胚状体,23培养基附加物对诱导率的影响 231活性炭对花药诱导率和褐化率的影响 活性炭具有较强的吸附作用，把它加入在培养基中主要是利用其吸附能力，吸附组织培养中外植体产生的有害物质，从而有利于组织培养在本实验中

36、，4份材料在加入0.3活性炭后，褐化程度减轻，褐化率都有不用程度的降低这表明在培养基中添加适量活性炭有助于减轻花药的褐化程度加入活性炭后7692-76、威芋3号、渝薯1号的诱导率有所提高，但是鄂马铃薯5号的诱导率反而降低这可能是由于活性炭的吸附作用无选择性，在吸附有害物质的同时，一些培养基的有效成分和植物生长调节剂也被吸附。,232马铃薯提取液对花药诱导率的影响 马铃薯富含许多天然有机成分，含有许多营养物质及植物生长调节剂，对植物花药培养非常有益从试验可以看出，5马铃薯提取液对7692-76、凉薯97、鄂马铃薯5号、康932-2这4份材料的花药诱导有促进作用凉薯97、鄂马铃薯5号、康932-2的花药培养在添加马铃薯提取液后，花药诱导率明显提高康932-2的诱导率提高48倍，凉薯97和鄂马铃薯5号的诱导率也提高了3倍与前三者相比，添加马铃薯提取液对7692-76的花药诱导效果不明显,24花药再生植株倍性鉴定和移栽本实验中共获得37株花药植株，9株为染色体数目未减半的四倍体，28株为单倍体植株，单倍体植株发生率为75.737株花药植株中，通过胚状体途径或直接再生植株途径生成的小植株有17株，经倍性鉴定全为染色体数目减半的单倍体；通过愈伤组织分化生成的植株有20株，经倍性鉴定有11株为染色体数目减半的单倍体单倍体花药植株矮小，茎干纤细，根系不发达，移栽成活率低，结薯少，结薯薯块小。,