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1、免疫酶组织化学技术专业知识讲座,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,非标记抗体免疫酶法(1969 Sternberger ),一、酶桥法（抗酶抗体法）二、PAP法 (1970Sternkerger 等）三、双PAP法（1975Vaeca 等）四、APAAP多聚螯合物酶法,2,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,非标记抗体免疫酶法(1969 Sternberger )一、,非标记抗体免疫酶法,Sternberger （1969）在酶标抗体法的基础上，创建了非标记抗体免疫酶技术。酶标抗体，酶与抗体的结合可损害部分抗体和酶的活性，从而降低了抗体的效价。另外，血清中的非特异性抗体也可以被酶标记，这些非特异酶标
2、记抗体与组织中相应抗原结合，放大了非特异背景染色。,3,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,非标记抗体免疫酶法Sternberger （1969）在酶标,非标记抗体免疫酶法,先用酶（HRP 或AKP）去免疫动物（羊、兔和鼠等），使其产生高效价、特异性的抗酶抗体，再将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，没有一个抗体受到共价键的标记，保留了免疫活性，相对分子质量较小，对细胞的穿透性好。,4,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,非标记抗体免疫酶法先用酶（HRP 或AKP）去免疫动物（羊、,一、酶桥法,原理：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成
3、酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。反应层次（四步法）： 抗原第一抗体 第二抗体（桥抗体） 抗酶抗体 HRP DAB+H2O2 有色沉淀物,5,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,一、酶桥法原理：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体）,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP底物,酶桥法,6,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP底物,酶桥法,注意点第一步桥抗体必须对特异性抗体（一抗）、抗酶抗体，均具特异性，才能连接两者抗原特异性抗体、抗酶抗体由同一种属动物产生第二步桥抗体应过量，当与特异性一抗结合后，仍有剩余的抗原
4、结合位点，使结合抗酶抗体，最后使酶通过免疫学原理与抗酶抗体结合,7,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,酶桥法注意点7免疫酶组织化学技术专业知识讲座,酶桥法,特点 用抗酶抗体 采用免疫反应原理（避免化学交联对酶抗体活性的影响） 一抗与抗酶抗体为同一种动物 二抗作为桥抗体连接二种IgG （ 同种动物） 优点 对酶活性及抗体效价影响小 非特异性染色比间接法轻 提高了灵敏度 缺点 手续较多，时间长,8,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,酶桥法特点 8免疫酶组织化学技术专业知识讲座,染色步骤1）4）同酶标抗体直接法。5）适当稀释的特异性一抗（例如来自种属A ) 37 孵育60min 或4过夜，PBS 洗33
5、min。6）第二抗体（也称桥抗体，抗种属A 的IgG 抗体）37 孵育40min，PBS洗33min。7）抗酶抗体（来自种属A ) 37 孵育40min，PBS 洗3x3min。8）酶（HRP 70100g/ml，PBS 溶解）37 孵育40min，PBS 洗3x3min。9）显色复染同酶标抗体直接法。因该方法比PAP 法麻烦，现已被PAP 法所取代，故很少应用。,9,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,染色步骤9免疫酶组织化学技术专业知识讲座,二、PAP法,酶桥法虽克服了酶标记抗体法的某些缺点，有效地保护了抗体及酶的活性，但抗酶抗体必须高度纯化，否则将降低其敏感性。一是由于抗酶抗体血清中含有高亲
6、和力和低亲和力两种抗酶抗体抗酶抗体血清中的非特异性抗体虽不能与酶结合，但能与第二抗体（桥抗体）结合，从而减少了抗酶抗体的结合，也影响到方法的敏感性。,10,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,二、PAP法酶桥法虽克服了酶标记抗体法的某些缺点，有效地保护,PAP法,Sternkerger 等（1970 ）在此基础上进行了改良，建立了辣根过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法原理：抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP复合物步骤：三步法 将酶桥法的第，步合并为，用复合物代替现将抗酶抗体和酶可溶性酶复合物常用事先制备好的PAP进行免疫酶染色故称PAP法（现有试剂：鼠、兔、羊PAP）,11,免疫酶组织化学技
7、术专业知识讲座,PAP法Sternkerger 等（1970 ）在此基础上进,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,HRP底物,PAP法,12,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP底物PAP法12免,PAP法,酶与抗体的比例个酶分子与个抗酶抗体结合形成亚单位构成环形体优点 抗原稍过量，所有的抗HRP 抗体均参与形成可溶性PAP 复合物 敏感性高 背景着色低（PAP 为复合物，不存在游离免疫球蛋白） 步骤简化（染色） 缺点 PAP 制备复杂，步骤多，时间长,13,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,PAP法酶与抗体的比例13免疫酶组织化学技术专业知识讲座,
8、染色步骤1） 4m 石蜡切片58 烤片4h，切片常规脱蜡至水。2）蛋白酶消化或AR （组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。3）0.3 % H2O2 处理切片20min （室温），PBS 洗3min2次4）3正常动物血清处理切片30min （室温），吸去多余血清，不洗。5）适当稀释的特异性一抗孵育（4 过夜或37 60min) ，PBS洗3min3 次6）滴加桥抗体（二抗），37 孵育40min，PBS 洗3min3。7）适当稀释的PAP 复合物（要求与特异性一抗同一种属）37 孵育40min。8）PBS 洗3min 3。9）0.04 % DAB-0.03 % H2O2显色812min
9、。10）水洗、复染、脱水、树胶封片，结果观察 注：根据具体情况可省略2）、3）步骤。,14,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,染色步骤14免疫酶组织化学技术专业知识讲座,三、双PAP法,原理：Vaeca 等（1975）建立了双PAP 法（double bridge PAP method） ，其基本原理是在PAP 法的基础上重复第二抗体和PAP 复合物，重复的连接抗体和PAP 复合物可能有两种连接方式抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物,15,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,三、双PAP法原理：Vaeca 等（1975）建立了双PAP,组织抗原,第一抗体,第二抗
10、体,PAP复合物,HRP,双PAP法,第一种重复连接抗体与特异性一抗分子上未饱和的Fc 段相结合，第一抗体上结合了更多的桥抗体和PAP 复合物。,16,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,组织抗原第一抗体第二抗体PAP复合物HRP双PAP法第一种,双PAP法,双PAP法,第二种重复连接抗体可与一个PAP 中的抗HRP 抗体上未饱和的Fc段结合，再与后加的PAP 复合物相结合,17,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,双PAP法双PAP法组织抗原第一抗体第二抗体PAP复合物HR,双PAP法,步骤：五步法 特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时，非特异背景重其染色步骤是在单PAP 法步骤18）的基础上重复6
11、8）步，然后继续以下操作。9）常规DAB-H2O2显色。10）水洗、复染、脱水、封片。注：根据具体情况可省略2）、3）步骤。,18,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,双PAP法步骤：五步法 18免疫酶组织化学技术专业知识讲座,四、APAAP法,免疫碱性磷酸酶组织化学技术是以碱性磷酸酶（AKP 或AP）取代HRP 来显示结果的免疫酶组织化学技术。1983 年Moson及Moir等建立了碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶( APAAP ）复合物法。,19,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,四、APAAP法免疫碱性磷酸酶组织化学技术是以碱性磷酸酶（A,免疫酶组织化学技术专业知识讲座培训课件,APAAP法,21,免疫
12、酶组织化学技术专业知识讲座,APAAP法21免疫酶组织化学技术专业知识讲座,APAAP法,注意点（同PAP 法） 一抗与第三抗必须来源于同一种属动物 二抗必须过量 优点 ALP 免疫组化染色，不受内源性过氧化物酶干扰，处理内源性ALP 较易 红色易与色素颗粒区别（用坚牢红时） 应用 含丰富内源性过氧化物酶的冷冻切片的首选方法（淋巴组织、肿瘤组织） 皮肤病理学中应用，可与黑色素相区别,22,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,APAAP法注意点（同PAP 法） 22免疫酶组织化学技术专,多聚螯合物酶法,许多年来，很多研究者都在努力使IHC 方法更敏感、更稳定、更简单，要求多步检测系统简化，但敏感性要
13、进一步提高，使这一技术面临巨大的挑战。一种新的多聚赘合物酶二步法在1995 年被隆重推出，该方法与简单的二步法相比较，具有很高的敏感性、稳定性和特异性。,23,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,多聚螯合物酶法许多年来，很多研究者都在努力使IHC 方法更敏,多聚螯合物酶法,HRP-多聚螯合物-抗体 以碳为骨架 以多聚糖 以氨基酸类为骨架,主要用于PowerVision 法，它可以折叠，其复合物颗粒小于EnVision 试剂，其敏感性好于EnVision 法。,主要用于UIP （universal immunoperoxidase polymer ）法，其敏感性基本与PowerVision 法相同。
14、,24,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,多聚螯合物酶法 HRP-多聚螯合物-抗体 主要用于,多聚螯合物酶法,25,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,多聚螯合物酶法25免疫酶组织化学技术专业知识讲座,多聚螯合物酶法,一、EPOS法 Enhanced polymer one-step staining原理：以具有惰性的多聚螯合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体和HRP结合在一起，形成特异性EPOS试剂，一步法完成,26,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,多聚螯合物酶法一、EPOS法26免疫酶组织化学技术专业知识讲,EPOS法,原理：形成HRP-多聚化合物-特异性抗体巨大复合物，该复合物内不含第二抗体及亲
15、和素，染色时，只需在组织切片上加入相应的酶标记特异性抗体EPOS 试剂，孵育3060min 即可完成。勿需再加酶标记第二抗体,27,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,EPOS法原理：形成HRP-多聚化合物-特异性抗体巨大复合物,EPOS法,组织抗原,一抗,HRP,多聚骨架,28,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,EPOS法组织抗原一抗HRP多聚骨架28免疫酶组织化学技术专,EPOS 法操作流程如下。 1）石蜡切片常规脱蜡至水，PBS 洗3min3 次。2）蛋白酶消化或抗原修复（AR ) ，PBS 洗3minx3 次。3）0.3 过氧过氢（H2O2）处理5min。4）蒸馏水洗，置于PBS 中洗5mi
16、n。5）加入相应的Dako EPOS / HRP 试剂，室温孵育3060min。6） PBS 洗3min 3 次。7）0.04% DAB-0.03% H2O2 显色812min。8）水洗，复染，常规树胶封片。,29,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,EPOS 法操作流程如下。 29免疫酶组织化学技术专业知识讲,EPOS法,步骤：一步法特点：目前最简便的方法，快速，特异性强，基本无背景染色 ，敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵,30,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,EPOS法步骤：一步法30免疫酶组织化学技术专业知识讲座,二、EnVision法（ELPS法）,Enhanced Labelled
17、 Polymer System原理：抗原抗体反应结合后，第二抗体上标记有多聚化合物（葡聚糖）酶复合物（EnVision 复合物），与第一抗体结合，进而由酶作用底物进行显色定位。,31,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,二、EnVision法（ELPS法）Enhanced Lab,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,32,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步32免疫酶组织化学技术,ELPS法,特点：敏感性高：（1 mol复合物中含70mol HRP和10 mol第二抗体） 特异性强：复合物内无内源性多聚化合的 干扰缺点：最大的缺点是葡聚糖骨架不能折叠，聚合物颗粒大，易形成空间位阻，细胞膜或核膜穿透较困难，影响方法的敏感性，有时会出现染色不均一。 干扰。,33,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,ELPS法特点：33免疫酶组织化学技术专业知识讲座,谢谢,34,免疫酶组织化学技术专业知识讲座,谢谢34免疫酶组织化学技术专业知识讲座,
