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1、第八章 PCR技术及其应用,前言 PCR技术简史第一节 PCR技术原理和工作方式第二节 PCR产物的克隆第三节 PCR扩增未知DNA片段第四节 与反转录相关的PCR第五节 PCR产生DNA指纹第六节 实时定量PCR,本课件是在网络资源基础上改进而成，在此对有关人士特致感谢！,一、PCR的基本原理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,第一节 PCR技术原理和工作
2、方式,Denature template DNA by heat (95 oC),Target Sequence,Target Sequence,模板DNA的变性：模板DNA经加热至95左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,PCR Cycle - Step 1 ,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1
3、,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNAPolymerase,引物的延伸：
4、DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,7,1 缓冲液,10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可
5、能有添加剂、共溶剂等。厂商一般以10倍的贮存液形式提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。厂商一般以25mmol MgCl2+形式提供，使用浓度为0.5mmol/L至2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,二、PCR反应体系,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,8,2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs) dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。 厂商一般提供为10mmol/L或4mmol/L的贮存液，使
6、用浓度为0.2mmol/L左右。 dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。 dNTPs可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,9,PCR引物的设计一般原则1.引物长度一般以1830bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。2.解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，较高时特异性增加，但退火效率下降，过低时退火效率较高，但特异性下降。两条引物间的Tm值越接近越好。计算Tm值的
7、方法很多，简易公式为Tm=4(G+C)+2(A+T)，适于短于20nt的引物。长引物的Tm值计算公式见书，但比实际值往往偏低。精确的Tm计算需要考虑缓冲液的盐离子浓度和引物内部的相邻碱基的动力学参数。,3、引物一般溶成10 mol/L的贮存液，使用浓度为0.1-0.5 mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,10,3.避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。4.要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发夹结构
8、。5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在4060%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。6.引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高，但3要避免较密的C+C或G+C连排。7.引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,11,4、模板 单、双链DNA均可。 一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较
9、理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素。 不同属性的模板所加的理想的量不同，哺乳动物基因组总DNA、酵母DNA、细菌DNA、质粒、M13噬菌体作模板时，需要的量分别为1g、10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,12,5、耐热性的DNA聚合酶有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍具有53聚合酶和53外切酶活性，但在35外切酶活性(proofre
10、ading, 校正功能，决定保真度, fidelity)、耐热性和附加功能上有差异。酶量增加使产量增加，但反应特异性下降，酶量过少虽能保证特异性，但影响产量。常用的有： 1）Taq DNA聚合酶：最常用，来自嗜热水生菌(Thermus aquaticus)，95时的半衰期为40分钟，75时活性最强，没有校正功能，错配率为8.910-5至1.110-4。标准使用浓度一般为2.5 U/50 l。 2）Tth DNA聚合酶：来自嗜热热细菌(Thermus thermophilus) HB8，95时的半衰期为20分钟，74时进行扩增，除在Mg2+催化下进行常规的PCR扩增外，还具有在MnCl2催化下的
11、高温反转录功能。 3）Vent DNA聚合酶：来自嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)，100时的半衰期为1.8小时，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,13,4）Pwo DNA聚合酶：来自嗜热细菌(Pyrococcus woesei)，100时的半衰期大于2小时，有校正功能，保真度高。 5）Pfu DNA聚合酶：来自激烈热球菌(Pyrococcus fariosus)，具有极高的热稳定性，目前公认是最保真的。 6）混合DNA聚合酶：将具有校正功能的酶与Taq酶按一定比例混合，具有类似Taq的强启动合成能力，同
12、时又有一定的保真度，而且具有一定的扩增长片段的能力。 Taq酶的延伸速度为1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min来预计。 PCR扩增不是绝对真实的，因为具校正功能的DNA聚合酶只是比不具校正功能的DNA聚合酶相对保真而已，错配率相差在两个数量级以内。 一些具校正功能的酶作PCR时，即使产物短也可能得不到产物，原因不明，估计可能与该酶的外切活性将引物降解有关。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,14,三、PCR反应程序1、常规程序： 94左右预变性几十秒至几分钟； 94左右变性10秒至1分钟； 50-65左右退火30秒至
13、1分钟； 20-35个循环 72左右延伸30秒至几分钟； 72左右最后延伸和加尾3-10分钟； 4-25保持3分钟或更长。2、退火和延伸温度： 退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5，较高时特异性强但退火效率低，较低时退火效率增加而非特异扩增增加，可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火。 当退火温度高到与延伸温度接近时，可以将退火和延伸温度合为一个，这时PCR就由三步法变成了两步法。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,15,3、反应时间： 变性步骤一般为5秒至1分钟，变性温度高时时间短，低时时间长，简单模板时间短，复杂模板时间长，尤其是直接用细胞
14、作模板时预变性和变性时间都要长。 退火时间一般为30秒至1分钟即可，引物结构好的时间短，引物结构差的退火时间宜长。 延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。Taq扩增时按1kb/min计算，具校正活性的酶则按0.6-0.7kb/min计算。4、循环次数： 多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。 PCR扩增的后期循环易进入平台期，实际上是由于PCR扩增条件的逐步劣化而引
15、起的。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,16,5、PCR反应液的配制： 加试剂顺序：双蒸水、缓冲液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。加DNA聚合酶前应将其余试剂混匀后再加入酶。加完酶后应先放回酶，然后再混匀PCR成分，覆盖矿物油，并上机。 酶要用冰盒取放，禁止因手的接触或暴露于空气中而使酶升温。 第一次使用各试剂时要轻柔充分混匀。 正确保存各种试剂，尤其是要避免核酸因反复冻融而降解，各试剂宜分装成适量的小管。 热启动(hot start)：购买的DNA聚合酶偶连有特异抗体，只有当温度升至68度或更高时，抗体才会失活并释放出DNA聚合酶，从而
16、增加PCR的特异性，减少低温下尤其是配制PCR体系过程中由于引物错配而带来的非特异性扩进。但启动的DNA聚合酶的价格较贵。早期有蜡珠法。 冷启动(cool start)：在冰水浴上配制PCR成分，然后立即放到已运行并暂停于预变性之初的PCR仪的block上面，直接进入高温变性和随后的PCR扩增。 延迟成分法：扣留一种PCR关键成分，直到已进入预变性后才加入。,PCR中其它注意的事项,1.防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作2.设立对照：阳性对照： 阳性模板阴性对照： 阴性模板、无模板试剂对照： 除模板外的所有组分,第二节 PCR产物的克隆,一、在PCR产物两
17、端添加限制性酶切位点在PCR引物的5加上根据需要而设计的酶切位点，PCR产物内部没有该切点。在酶切位点的5加3个左右的保护碱基，基数目多少取决该酶的性质。PCR物产物经电泳后回收后，直接用限制酶进行切割，纯化后与目标载体连接重组。该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,20,二、TA克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。Taq酶PCR产物的特点
18、：该酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3末端加上一个突出的A。T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其每条链的3末端具有一个突出的T，如promega公司的pGEM T-easy。TA克隆：将3末端具一个突出的A的PCR产物与T载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其它载体进行功能研究等。pCR-TOPO技术：T载体上已经偶连有拓扑异构酶，因此PCR产物无需DNA连接酶而可直接与该T载体进行快速连接重组。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,21,三、平末端DNA片段的克
19、隆所有具有校正功能的DNA聚合酶扩增出来的PCR产物均为平末端，有两种克隆思路：一是在PCR完成后加入适量的Taq酶并在72保温20-30分钟，使PCR产物每条链的3末端加上一个突出的A后进行TA克隆。二是将平末端PCR产物与平末端进行载体连接克隆：1、pCR-Script Amp SK(+)克隆载体：连接体系中除加有T4 DNA连接酶外，还加有限制酶Srf，连接过程中载体自连的产物总是被Srf切开，而重组载体确不能被切开，转化子中重组子的比例就较高。2、pCR-Blunt克隆载体：载体的lacZ基因下游融合了一个致死基因ccdB，载体自连转化的大肠杆菌不能存活，重组载体的转化子则能长成菌落，
20、因为致死基因已被插入失活。,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,22,四、长片段DNA的PCR扩增长片段DNA的PCR扩增效率较低，因为有许多降低PCR效率的因素。策略有：一是改进PCR缓冲液体系。二是采用混合酶，尤其是Taq与Pwo的混合酶可扩增40kb左右的片段。,一、反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,
21、第三节 PCR扩增未知DNA片段,二、利用接头的PCR/锚定PCR (anchored PCR),将基因组总DNA用限制酶切割，然后将序列已知的接头连接到酶切片段的两端，以提供PCR的锚定引物，该锚定引物与已知序列中的基因特异引物(gene-specific primer, GSP)组合后，用于目标基因侧翼序列的扩增。为了减少锚定引物与锚定引物之间组合后构成的非特异扩增，可以将接头替换为一端平、另一端为5突变的结构，且对3凹陷的碱基实行亚氨基修饰。,不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5
22、M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,三、热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR),2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,26,TAIL-PCR：利用特异引物与随机引物组合后进行PCR，产生3种产物：型产物：特异引物和随机引物共同延伸的产物；型产物：特异引物单独延伸的产物；型产物：随机引物单独延伸的产物。5轮高严谨度PCR，形成特异引物介导的目标序列的单链扩增；1个低严谨度PCR循环，将目标序列转换为双链；高严谨度与低严谨度循环交错进行，共14
23、个超级循环；PCR产物稀释1000倍；换用新的特异引物与随机引物进行第二次扩增，10个超级循环；PCR产物稀释1000倍；换用第三特异引物与随机引物进行第三次扩增，10个超级循环；电泳、回收、克隆、测序。,RT-PCR：以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应，用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变，呈现mRNA多态性，克隆mRNA的5和3末端序列，以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。PCR与模板定量：PCR最终产物是其模板的一定程度的放大，因此PCR产物的量可以间接反映初始模板的量。但正因为PCR是对初始模板的指数式扩增，如果不同样品之间在扩增中偏离指数的程度
24、稍有不同，用PCR产物来反映初始模板丰度就会有很大的误差。通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮产物的累积数量，可以很好地推算初始模板丰度，这种工作方式叫做实时定量PCR (real-time PCR)。由于实践中是用荧光信号来检测PCR产物的积累动态，所以该技术又叫实时荧光定量PCR (RT-qPCR)。,第六节 实时荧光定量PCR,2022/12/30,西南大学生物技术专业 基因工程,28,一、实时荧光定量PCR的定量方式RT-qPCR仪同时进行PCR扩增和荧光检测，监测动态变化。阈值(threshold)：RT-qPCR扩增开始后，将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度值。Ct值：荧光信号达到阈值所对应的PCR循环数，它具有极好的重复性。基线：从第3个循环起到Ct值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般以3-15之间。Ct值是一个完全客观的参数，通常在18-30之间。它与初始模板拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,
