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1、PCR技术的应用,1、PCR技术在分子生物学中的应用,一：基因克隆,基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生物学研究中必不可少的手段。运用PCR技术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切、连接到载体DNA上、转化、建立DNA文库及基因的筛选、鉴定、亚克隆等烦琐的实验步骤。,二：重组PCR,在分子生物学研究中常常需要将两个不同的基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容易地实现这一目的。,三：DNA序列的测定,目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双
2、脱氧法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定位于两个引物之间的序列。,四：用于基因定量,应用PCR技术可以定量监测标本中靶基因的拷贝数，这在研究基因的扩增等方面具有重要意义，这种方法称为差示PCR(differential PCR)。它是将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于同一个试管中进行PCR扩增。电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度；或在引物5端标记上放射性核素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷
3、贝数。利用差示PCR还可以对模板DNA(或RNA)的含量进行测定，在一系列PCR反应中，分别加入待测模板DNA和参照DNA片段。参照DNA片段基本上按待测DNA的方式进行构建，但增加了一小段内部连接顺序，这样使得两种DNA片段的PCR产物可在凝胶电泳上分开。由于这两种不同的DNA片段可以在同一种寡核苷酸引物作用下同步扩增，因此可以避免因使用不同的引物所引起的可能误差。这两种扩增产物的相对量就反应了在起始反应混合物中的目的DNA和参照DNA的相对浓度。 利用差示PCR同样可以做mRNA的定量。与DNA模板含量测定基本相似，所不同的是首先应提取总RNA，加入一个与mRNA 3 7区互补的引物，在逆
4、转录酶的作用下，合成cDNA，其余的操作与DNA定量相同。利用PCR可以对tuRNA(如进行性肌萎缩蛋白mRNA)作比较准确的定量，甚至连Northern印迹杂交未能发现的1TIRNA都可以得到检测。,2、PCR技术在传染病病原体检测中的应用,PCR是一种具有高敏感性、且特异性好的靶DNA快速检测方法，能对前病毒或潜伏期低复制的病原体特异性靶DNA片段进行扩增检测，只要标本中含有lfg靶DNA就可检出。可检出经核酸分子杂交呈阴性的许多标本，而且对标本要求不高，经简单处理后就能得到满意扩增。可做到早期及时诊断，对防止传染病流行有重要意义。,3、PCR在肿瘤相关基因检测中的应用,寡核苷酸探针杂交法
5、限制性内切酶切片段长度多态性(RFLP)技术PCRRFLP技术RNA酶A错配清除法核酸序列分析法,4、PCR技术在遗传病早期诊断中的应用,基因诊断技术的发展是现代医学发展的一个重要标志，它从基因水平开辟了诊断学新领域。聚合酶链反应(PCR)技术是基因诊断主要技术之一，以PCR为基础的各种分子生物学新技术在遗传病的基因诊断等方面得到广泛的应用。由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速、准确地检测人类遗传病开辟了新途径,5、PCR
6、在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用,HLADRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的DNA经PCR扩增HLADR卢区基因的高度多态区域，在分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循环，扩增产物经12的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列形成异型双链，因此，混合匹配可
7、进一步证实HLADRfl是否相合。,6、PCR技术在法医学鉴定中的应用,PCR技术用于生物物证的分析，与RFLP技术相比，具有操作简单、省时、成本低廉的优点，还可避免同位素分析所带来的一系列问题，如放射性污染、操作时的人身防护以及材料来源困难等。近年来，在PCR技术基础上，又发展了许多基因位点分型系统，用于法医物证的DNA分析，其中发展最为完善并得到公认的是HLADQa位点的分型系统，此系统应用PCR技术扩增HLADQa基因特异片段，结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术检测HLADQa位点的4个等位基因，有特异性好、灵敏度高、结果稳定可靠等优点，成为国际上法医科学中应用PCR技术进行个人识别和亲子鉴定最有效的方法。,7、PCR在进化分析中的应用,rRNA基因有“化石”之称，PCR扩增并分析其序列，可分析比较界或门分类水平上的生物。通常，细胞核小亚基rDNA的序列进化相对较慢，主要用于种系关系较远的生物比较研究；而线粒体rRNA基因进化非常快，可在科目水平上进行不同生物的比较；转录的间隔区序列和核rRNA的基因间隔区重复单位序列进化最快，可用于同属异种或不同群之间的分析比较。,
