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1、环境毒理学实验,授课教师：苏增建试验地点：环境毒理实验室适用专业：环境科学相关专业,实验一 蚯蚓急性毒性实验,一、目的与要求（1）学习和掌握滤纸接触毒性实验和人工土壤实验的基本原理和方法。（2）初步了解评价环境中化学物质对土壤中动物急生伤害的标准和基本步骤。,二、原理滤纸接触法毒性实验简单易行，可对受试物毒性进行初筛。将蚯蚓与湿润的滤纸上的受试物接触，测定土壤中受试物对蚯蚓的潜在影响。人工土壤实验系统将蚯蚓置于含不同浓度受试物的人工土壤中，饲养7d和14d，评价其死亡率，评价受试物对蚯蚓的急性毒性作用。,实验一 蚯蚓急性毒性实验,实验一 蚯蚓急性毒性实验,三、设备与材料1、主要仪器和设备玻璃容
2、器：平底玻璃管（3cm8cm）培养装置：光强400-800 lx的温控培养箱中性滤纸：80-85g/m2移液器、塑料薄膜、烘箱、电吹风,实验一 蚯蚓急性毒性实验,2、试验生物选用二月龄以上，体重300-500mg左右的健康赤子爱胜蚓。实验前应在实验室条件下驯养2周以上。,实验一 蚯蚓急性毒性实验,3、人工土壤人工土壤基质组成（干重）：（1）10%干牛粪（PH为5.5-6.0，磨细，风干，测定含水量）；（2）20%高岭黏土（含50%以上高岭土）；（3）70%石英沙（0.05-0.2mm粒径的石颗粒50%以上）；（4）混合人工土壤的组成成分，加入蒸馏水使其含水量为干重的25%-42%，混合均匀。,
3、实验一 蚯蚓急性毒性实验,四、方法和步骤1、清肠用蒸馏水清洗蚯蚓，然后置于铺有滤纸的磁盘上清肠24h，用去离子水冲洗后，滤纸吸干称重，供试。注：清肠过程用薄膜包紧磁盘，防止蚯蚓爬出磁盘死亡。,实验一 蚯蚓急性毒性实验,2、滤纸实验在平底试管内壁衬滤纸，铺满不重叠；设5个浓度梯度（见附表）及对照共6组试管，每组10个重复，每个试管内首先移取1ml对应浓度的受试物溶液，用洁净空气吹干，然后每个试管加入1ml去离子水，然后加入1条蚯蚓，用薄膜封口，在黑暗、202环境培养48h，每24h观察一次，记录死亡情况，同时还有蚯蚓的病理症状和行为。,实验一 蚯蚓急性毒性实验,选择浓度范围的预试验,注：受试物溶
4、于水（1000mg/l）或丙酮等助溶剂，配成系列浓度,实验一 蚯蚓急性毒性实验,3、人工土壤试验正式试验前，需进行浓度范围选择实验。最终设定至少5个浓度梯度级及空白组，浓度范围应包括最大耐受浓度和致死浓度两组浓度，每组至少有4个平行样。受试蚯蚓需在人工土壤中先驯养24h，实验前冲洗干净。实验进行14d，每7d观察蚯蚓的病理症状及行为、死亡。测定介质中的含水量。,实验一 蚯蚓急性毒性实验,4、质量控制可在实验中加入阳性对照组（氯乙酰胺），空白组用去离子水代替受试物，实验结束后空白对照组死亡率应不超过10%。,实验一 蚯蚓急性毒性实验,五、结果及实验报告记录不同受试物浓度对应的死亡情况，实验报告就
5、包括以下内容：受试物的基本物化性质；实验动物的饲养条件等；试验条件包括温度、湿度、光照条件、实验介质的成分级成和制备条件；实验结果报告。,实验一 蚯蚓急性毒性实验,六、注意事项1、牛粪与其他人工土壤成分混合前应充分磨细风干、烘干，测定含水量；2、蚯蚓驯养条件：温度18-22 ，持续光照（强度400-800 lx ），保证湿度；,实验一 蚯蚓急性毒性实验,3、实验中管口或瓶口必须用薄膜封紧并保证通气，防止蚯蚓钻出；4、根据LC50值可将农药对蚯蚓的毒性划分三个等级：10ppm的为低毒农药,实验二 有机磷农药对胆碱酯酶活性的抑制,一、目的与要求1、了解有机磷杀虫剂共同的特性，即对昆虫或高等动物体内
6、胆碱酯酶的活性能起抑制作用，而引起动物中毒死亡。2、利用这一原理测定各种有机磷杀虫剂在动、植物体内的残留毒性，为安全使用农药提供依据。,实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验,二、原理当高等动物或昆虫被有机磷杀虫剂作用之后，体内胆碱酯酶就受抑制，不能继续起水解作用，因此，它们体内的乙酰胆碱大量积累，而导致中毒死亡,实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验,三、设备与材料1、设备：可见光分光光度计；试管13支，移液器；振荡水浴锅，烧杯，研钵。2、试剂：（1）0.004M溴化或氯化乙酰胆碱；（2）2M盐酸羟胺溶液；（3）3.5N NaOH；（4）4N盐酸溶液；（5）0.37M三氯化铁溶液。,实验二
7、有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验,四、步骤与方法1、将台面的大试管进行编号1-9（其中6号管为空白管，9号管为对照管），另有一支2ml有盖管；2、每一排所有组将芽虫放在一起，加入5倍左右的冷冻蒸馏水，进行研磨，然后将浆液全部倒入离心管中，在2500rpm离心15min，取离心管中上清液作为正常虫浆，共用；,实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验,3、各小组向2ml管加入0.5ml正常虫浆，然后由老师帮忙加入20l0.1%敌百虫液，放置15分钟；4、向1-6号管分别添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.0ml试剂（1），再分别加入1.3、1.1、0.9、0.7、0.5、0.5磷酸盐缓冲液
8、，摇匀；向7号管中分别加入0.5ml无处理的正常虫浆，向8号管中加入0.5ml敌百虫处理过的虫浆，然后分别向7-9号管加入1ml试剂（1），摇匀；,实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验,5、将6-9号管放入37振荡水浴锅中，40min后取出；6、向6号管中加入1ml试剂（4），摇匀后；7、分别向1-9号管中加入2ml试剂（2）与试剂（3）的混合液（1：1临时配用），大力摇动1min以上；,实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验,8、向9号管中加入0.5ml正常虫浆；9、除6号管外，分别向各管（1-5号、7-9号）加入1ml试剂（4），摇匀；10、向1-9号管加入1ml试剂（5），各管即呈现深浅不同的红棕色，用可见光光度计（540nm进行测定）。,实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验,五、结果与报告要求作出乙酰胆碱标准曲线，根据这条标准曲线求出样本所含的乙酰胆碱量，从而计算出胆碱酯酶被抑制的百分率。,实验二 有机磷农药对胆碱酯酶的抑制实验,六、注意事项1、受试生物如果是荔枝蝽，则需雄雌各3头，实验时需去除雄性的睾丸，剪去翅膀、附肢、触角等，研磨后需用玻璃丝过滤；2、手工研磨时可先加少量冷冻蒸馏水，快速研磨后再加适量冷冻蒸馏水磨拌均匀。,
