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1、单个微生物细胞,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。,同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加,如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一步生长,群体的生长,个体生长 个体繁殖 群体,群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,数,量,量,第一节 测定生长繁殖的方法,一、 测生长量,二、 计繁殖数,1、 直接法：用血球计数板在显微镜下进行计数,二、 计繁殖数,2、 间接法：用平板菌落进行的活菌计数,菌数/mL = cfu X 稀释度 X 10,第二节 微生物的生长规律,一、 微生物的个体生
2、长和同步生长,三、 微生物的连续培养方法,二、 微生物的典型生长曲线,获得微生物纯培养的方法概念：从一个细胞得到的后代称为纯培养。方法：稀释倒平板法；划线法。,一、 微生物的个体生长和同步生长,同步培养（synchronous culture）：即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂同期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。同步生长通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态；,二、单细胞微生物的典型生长曲线(growth curve),将少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气（厌氧菌除外）等条件下
3、，它们的群体会有规律地生长起来。每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，可以画出一条有规律的曲线即单细胞微生物的典型生长曲线。生长曲线代表了单细胞微生物在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。,微生物的典型生长曲线(growth curve), 延滞期 (lag phase), 对外界不良条件例如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感。,指少量微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。, 生长速率常数R等于零。, 细胞形态变大或增长。, 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。, 合成
4、代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。,影响延滞期长短的因素,（1）接种龄,（2）接种量,（3）培养基成分, 延滞期 (lag phase),出现延滞期的原因？,把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为0，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程 。,延滞期出现原因,缩短延滞期的意义和方法,接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄,加大接种量,用与培养菌种相同组成分的培养基, 指数期 (exponential phase),是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。, 生长速率常数R最大，代时G最短；,
5、整个群体的生理特性较一致；, 酶系活跃，代谢旺盛。, 细胞各成分平衡增长，生长速率恒定；,三个重要参数,（1）繁殖代数(n),（2）生长速率常数(R),（3）代时(G), 指数期 (exponential phase),G = (t2-t1) / n = (t2-t1) / 3.322(lgX2-lgX1),R = 1 /G = 3.322 (lgX2-lgX1) / (t2-t1),X2 = X1 2n 两边取对数：lgX2 = lgX1 + nlg2 （lg2 =0.301）n = 3.322 ( lgX2 - lgX1), 指数期 (exponential phase),影响代时长短的因
6、素,（1）菌种,（2）营养成分,（3）营养物浓度,（4）培养温度,营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响, 指数期 (exponential phase),指数期的实践意义,指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点。（1）用作代谢、生理等研究的良好材料；（2）是增殖噬菌体的最适宿主；（3）是发酵工业中用种子的最佳材料。（4）进行染色、形态观察等的良好材料。, 稳定期(stationary phase),又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时的生长速度又逐渐趋向零。,出现原因,营
7、养的消耗营养物比例失调有害代谢产物积累PH值等理化条件不适, 稳定期(stationary phase),生长速率常数R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等；,菌体产量达到最高点，且产量与营养物质的消耗出现有规律的比例关系，用生长产量常数Y表示；,Y = (X-X0) / C0-C = (X-X0) / C0,X ：稳定期的细胞干重(g/ml培养液）X0 ：刚接种时的细胞干重C0 ：限制性营养物的最初浓度(g/ml)C ： 稳定时期限制性营养物的浓度,菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系。细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；通过复杂的次生
8、代谢途径合成各种次生代谢物。,通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建；,对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸)等为目的的一些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期：,是对维生素、碱基和氨基酸等生长因子进行生物测定的最佳测定时期；,稳定期的实践意义,细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活细菌的数目急剧下降，出现“负生长”，此阶段叫衰亡期，又称死亡期。,IV 衰亡期 (death phase),IV 衰亡期 (death phase),1、特点：（1）细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生
9、长” （ R0 ） ；（2）细胞出现多形态，畸形或衰退形；（3）因菌体本身产生的水解酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等。（4）有的微生物进一步合成或释放次生代谢物。（5）芽孢杆菌在此期释放芽孢等。,影响衰亡期的因素及实践意义,与菌种的遗传特性有关: 有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡, 有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；与是否产芽孢有关：产芽孢的细菌更易于幸存下来；与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。,单细胞微生物生长的四个时期,不立即繁殖,繁殖速度最快,出生率等于死亡率,活菌数
10、最大,代谢产物大量积累,死亡超过繁殖,适应新环境,条件适宜,生存条件开始恶化,生存条件极度恶化,代谢活跃,体积增长较快,个体形态和 生理特性稳定,有些种类出现芽孢,出现畸变,与菌种和培养条件有关,生产用菌种科研材料,改善和控制条件,延长稳定期,细胞裂解释放产物,三、 微生物的连续培养方法,分批培养：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。,分批培养与连续培养的比较,
11、是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液保持恒定的连续培养方法；主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。,1. 恒浊器 (turbidostat),特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,2、恒化器 (chemostat),是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行繁殖的连续培养装置；主要获得不同生长速率的菌体；,特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。,恒浊器与恒化器的比较,连续
12、培养的优缺点,优点高效自控产品质量稳定节约动力、人力、水和蒸汽等缺点菌种容易退化容易污染杂菌营养物的利用率低于单批培养,连续发酵,将连续培养用于发酵，即为连续发酵，相对于单批发酵而言。SCP的生产、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的发酵、石油脱蜡、污水处理等应用。优点： 高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定；节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。,第三节 影响微生物生长的主要因素,一、 温度,二
13、、 氧气,三、 pH值,一、温度对微生物生长的影响,温度对微生物的影响具体表现在直接影响细胞内的各种生化反应：影响酶活性：温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性：温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输。影响物质的溶解度，对生长有影响。,温度是影响微生物生长的一个重要因子。每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度。最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。,以青霉素的生产为例： 培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30 培养提高了14.7%。 分段控制方式：05小时，30 ； 54
14、0小时，25； 40125小时，20； 125165小时，25。,微生物的三种类型(温度）,二、氧气对微生物生长的影响,根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌（ 必须有氧存在） 好氧菌 微好氧菌（有氧无氧均可，但有氧更好） 兼性好氧菌（只在较低的氧分压下生长 ） 耐氧厌氧菌（不需氧，但有氧也能生存， 氧无毒害） 厌氧菌 (专性)厌氧菌（氧有毒害，甚至致死）,专性好氧菌：必须在有分子氧的条件下才能生长；细胞含有超氧物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶。绝大多数真菌、多数细菌和放线菌。兼性好氧菌：在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好；细胞含有SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌
15、和不少细菌。微好氧菌：只能较低的氧分压下才能正常生长，。霍乱弧菌、发酵单胞菌属、弯曲菌属等。,耐氧菌：生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。乳酸菌多为耐氧菌。厌氧菌：分子氧对它有毒害。生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,五类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态（模式图）,好氧菌 兼性好氧菌 厌氧菌 耐氧菌 微好氧菌,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施:培养好氧微生物：需振荡或通气，保证充足的氧气。培养专性厌氧微生物：需排除
16、环境中的氧气，同时在培养基中添加还原剂，降低培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,各类菌所含对氧解毒酶,专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD， 过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 过氧化物酶,厌氧菌体内无SOD(超氧化物歧化酶)，因此受生物体内普遍存在的超氧阴离子自由基的毒害作用。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说：,生物体中超氧阴离子的形成与去除,O2 + e O2- 超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。超氧物阴离子歧化酶（SOD）是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式。,三、pH值对微生物生长影响,（
17、一）环境pH值对微生物生长的影响影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.55产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,微生物的生长pH值范围极广，从pH10都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。,(一) 嗜中性微生物 生长的pH范围是pH5.8.0，最适生长pH近中性（pH7.0
18、）。大多数细菌属于嗜中性微生物。（二）嗜酸性微生物 最适生长pH在5.5以下生长的微生物称之为嗜酸性微生物。 （三）嗜碱性微生物 生长的pH范围是pH7.011.5，最适生长pH在8.0以上。,（二）微生物细胞内的pH值,虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。,（三）微生物的生命活动对环境pH值的影响,微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因：由于有机物分解：分解
19、糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降；分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升由于无机盐选择性吸收：铵盐吸收 (NH4)2SO4 H2SO4， pH硝酸盐吸收 NaNO3 NaOH， pH,NH4+被吸收,NO3-被吸收,措 施,第四节 微生物培养方法概论,1、好氧菌的实验室培养,2、厌氧菌的实验室培养,高层琼脂柱,厌氧罐技术,厌氧手套箱,3、生产实践中培养微生物的装置,第五节 有害微生物的控制,1、灭菌 (sterilization),采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如各种高温灭菌措施等。,2、消毒 (disinfectio
20、n),消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。 举例：一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法等；,3、防腐(antisepsis),防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。防腐的常用措施低温缺氧干燥高渗高酸度防腐剂,4、化学治疗 (chemotherapy),它是利用具有高度选择毒力（selective toxicity，即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到
21、治疗该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂；一些重要的化学治疗剂种类：各种抗生素磺胺类药物中草药中的有效成分等,灭菌、消毒、防腐和化疗的比较,（一）物理方法高温灭菌,烘箱内热空气灭菌法,150170 12h 彻底杀灭细菌； 适用于金属和玻璃器皿的灭菌；,火焰灼烧法,仅适用于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。,干热灭菌法,1、热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强；2、热蒸汽比热空气穿透力更强；3、蒸汽存在潜热，当气体转变成液体时可放出大量热量；4、可迅速提高灭菌物体的温度。,相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌好；,湿热灭菌法,湿热灭菌法分类,1、常压下（1）巴斯德消毒
22、法：一种低温湿热消毒法。低温维持法： 63，30min处理牛奶。高温瞬时法： 72，15s处理牛奶。（2）煮沸消毒法 将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物品的目的。,（3）间歇灭菌法（分段灭菌法、丁达尔灭菌法）,80100 ，1560 min 杀灭所有微生物的营养体； 37 或室温保温过夜，诱发芽孢萌发为营养体； 重复上述步骤三次，在较低的灭菌温度下彻底灭菌； 适用于不耐热培养基的灭菌。,2、加压下,（1）高压蒸汽灭菌法利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100以上高温灭菌的方法。方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持1520
23、min。 112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）2030min。 115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）2030min。应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度。例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 。 含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 。适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,高压蒸汽灭菌锅构造,1、压力表2、安全阀3、放气阀4、软管5、紧固螺栓6、灭菌桶7、筛架8、水,手提式高压蒸汽灭菌锅,1、加水至止水线；2、灭菌物品包裹好；3、开启放气阀；4、加热排气；5、达到预定表压，开始计时；6、关闭热源，当压力降至0.05MPa时，缓慢开启放气阀。,高压蒸汽灭菌锅使
24、用方法,（2）连续加压蒸汽灭菌法（连消法） 加压条件下，培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流入发酵罐。优点：（1）可以减少培养基中的有效成分因长时间加热而遭受的破坏；（2）所用时间短，提高发酵罐的利用率；（3）提高锅炉使用效率；（4）适宜工业化生产 。,4、过滤,2、辐射：紫外线、电离辐射和强可见光等,3、干燥和渗透压（高渗）,其他物理控制方法,过滤除菌,（二） 化学方法杀菌,1. 表面消毒剂(surface disinfactant),消毒剂:对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞内或机体内治疗用的化学药剂。主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。如皮肤、粘膜
25、、伤口等处防止感染。消毒防腐剂的作用机理使微生物蛋白质凝固变性，发生沉淀。如酒精等；破坏菌体的酶系统，影响菌体代谢。如过氧化氢等；降低微生物表面张力，增加细胞膜的通透性，使细胞发生破裂或溶解。如来苏儿等酚类物质。,消毒剂杀菌的规律低浓度时，会对微生物的生命活动起刺激作用，随浓度的增加，相继出现抑菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱。表面消毒剂的相对杀菌强度石炭酸系数（P.C.）在一定时间内，被试药剂杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸最高稀释度之比。,常用表面消毒剂及应用,影响消毒剂作用的因素,是指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择性毒性的化学药剂；根据来源分为两类：人工合成
26、(主要是一些生长因子类似物)抗代谢药物：磺胺类药物；微生物产生抗生素,2、 化学治疗剂 (chemotherapeutant),（1）磺胺类药物 生长因子类似物,是第一个发现的生长因子类似物药物； 也是人类第一个成功地用于特异性抑制某种微生物的生长来治疗疾病的化学治疗剂。,对氨基苯甲酸（PABA） (正常代谢物）,磺胺 (代谢物拮抗物）,磺胺类药物的杀菌机制PABA代谢类似物,二氢叶酸,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸还原酶,四氢叶酸,辅酶F,核酸合成,细菌体内合成叶酸,二氢蝶啶,二氢蝶酸,二氢蝶酸合成酶,二氢叶酸,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸还原酶,四氢叶酸,辅酶F,核酸合成,磺胺药,TMP,细菌体内叶
27、酸合成受阻,二氢蝶啶,二氢蝶酸,二氢蝶酸合成酶,PABA,假二氢叶酸,TMP(三甲基苄二氨嘧啶)磺胺增效剂,为什么磺胺对人体细胞无毒性？ 因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，故不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用营养物中的叶酸做为生长因子。,（2）抗生素 (antibiotics),一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰他种生物（包括病原菌、病毒和癌细胞等)的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂；目前在临床上应用的抗生素仅五六十种。,抗生素的抗菌谱,由于不同微生
28、物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱。,抗生素的作用机制,抑制细胞壁合成； 干扰细胞膜的功能； 抑制蛋白质的合成； 抑制核酸的合成；,青霉素抑制藤黄微球菌的生长,1.抑制细胞壁合成,TMP,磺胺药,PAPB,细胞膜,多粘菌素短杆菌肽,链霉素卡那霉素 四环素,3.抑制蛋白质合成,红霉素氯霉素,2. 抑制RNA合成,2.抑制DNA解旋酶,诺氟沙星 新生霉素,主要抗生素和化学治疗剂的作用模型,利福霉素利福平,3.抑制蛋白质合成,4. 干扰细胞膜合成,5.抑制细胞代谢,微生物的抗药性,抗药性主要通过遗传途径产生，如基因突变、遗传重组或质粒转移等。,1、产生一种能使药物失去活性的酶；2、把药物作用的靶位加以修饰；3、形成“救护途径”；4、使药物不能透过细胞膜；5、通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外。,微生物产生抗药性的原因,白点是强度各异的抗生素，最底下的青霉素完全没有透明环，显示它对链球菌已毫无作用。,
