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1、第十二章固 相 膜 免 疫 测 定,临床免疫学和检验,Department of Immunology and Microbiology Yang Hui-jun November 8, 2010,Changsha,China,Solid Phase Memberane-based Immunoassay,一、固相免疫测定,B与F分离,Ab* Ab*Ag + Ag + Ab* Ab Ab,第一节 概述,二、固相膜的特点,多孔性 毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性易于漂洗 操作简便,三、常用的固相膜,玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀( polyvi
2、nylidene fluoride ，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜,四、固相膜的技术要求,孔径：0.20.6m或510m流速：以ml/cm2/min表示蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cm2表示均一性,固相NC膜,五、固相微孔膜测定种类,1.斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)2.免疫层析试验（immunochromatography assay, ICA）3.斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA) 4.酶联免疫斑点试验(
3、enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 5.免疫印迹法(Immunoblotting Test, IBT) 6.放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay, RIPA),六、膜固相免疫测定的特点,第二节 免 疫 金 标 记 技 术 (Immunogold Labelling Techique),临床免疫学和检验,一、概述,1.概念 以胶体金作为标记物的免疫检测技术2.类型 免疫金组织化学技术 金免疫技术 金免疫测定技术,二、胶体金基本知识,1.胶体金的制备(1)在一定浓度的金溶液内加入定量的还原剂使金离子变成金原子，
4、形成金颗粒悬液，即胶体金（colloidalgold）,也称金溶胶（goldsol）。(2) HAuCl4是主要原料，常用的还原剂有柠檬酸钠等。良好的胶体金应清亮透明，在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入NaN3防腐。,2.四种粒径胶体金的制备及特性,胶体金粒径 胶体金特性（nm） 呈色 max,16 橙色 518nm 24.5 橙红 522nm 41 红色 525nm 71.5 紫色 535nm 通过改变柠檬酸钠的用量可制得不同大小的胶体金颗粒,方 法 金颗粒直径白 磷 法 512nm抗坏血酸法 813nm枸橼酸钠法 1695nm柠檬酸钠法 16147nm乙醇-超声波法 610nm硼酸钠法
5、 25nm鞣酸-枸橼酸钠法 15nm,还原剂不同，胶体金颗粒大小及特性不同,胶体金（Colloidal Gold）1560 nm,优质,劣质,三、免疫金的特性和制备,胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组化技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时，胶体金多与免疫活性物质（Ag或Ab）结合，这类结合物常称为免疫金。,胶体金结合物（Conjugate）,四、免疫金（银）染色（Immunogoldsilver Staining，IGSS ）,金标抗体,待测抗原,+,金标抗体-抗原,银染液,银（金标抗体-抗原）,银离子的还原剂：对苯二酚胶体金及银原子起催化作用,免疫
6、金（银）染色应用,多用于组织化学检测 敏感度低于其它标记免疫技术，但经银加强染色后敏感度与荧光免疫技术和酶免疫技术相当近年来发展了不少IGSS方法以替代荧光免疫技术，可以在普通显微镜下进行检测,五、金免疫测定,斑点金免疫渗滤试验（Dot Immunogold Filtration Assay ,DIGFA） 金免疫层析试验（gold immunochromatography assay，GICA）,1.斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）,原理 硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的吸附性及可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成,DIGFA原理图,操作示意图,装
7、置分解图,盖,微孔膜,吸水垫料,底,技术类型,双抗体夹心法 包被抗体 待检抗原 金标抗体间接法 包被抗原 待检抗体 金标抗抗体竞争法 包被抗原 待检抗原 金标抗体,斑点金免疫渗滤试验（DIGFA),技术要点,试剂盒组成免疫金标记物渗滤装置（充满吸水垫料的塑料小盒,盒盖中央的小孔下面放置一片NC膜,膜上预包被Ag或Ab斑点） 洗涤液,斑点金免疫渗滤试验（DIGFA),2.胶体金免疫层析试验,原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端横向渗移，犹如横向层析一般，层析过程中在适当部位进行抗原抗体反应,胶体金免疫层析试验,技术类型双抗体夹心法竞争法间接法,双抗
8、体夹心法测抗原,胶体金免疫层析试验,ICA间接法测抗体,胶体金免疫层析试验,IFA与ICA的比较,GIFA技术的发展（间接法测抗体）,ICA技术的发展,1990年 ABBOTT公司 胶体硒标记ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.13 ng/ml 合成TnT质控点,S,C,TC2 C1,测定线,对照线,半定量测定,金免疫测定方法特点,试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条。 1.吸水材料 2.免疫金复合物干片（下），硝酸纤维素膜 （上）T：
9、硝酸纤维素膜条包被特异抗体， R：参照区，包被有抗小鼠IgG。,金免疫测定方法评价,简便、快速、单份测定，立等结果，除试剂外无需任何仪器，且试剂稳定，适合于急诊检验，但不能定量。(point of care test,POCT)”,金免疫测定应用,1.临床应用：定性分析，主要检测正常体液中不存在的生物活性物质，以及正常情况下体液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。（1）传染病：病毒相应抗原、抗体；性病病原体；细菌；寄生虫。（2）激素：生殖标志物，如诊断早早孕HCG、检测排卵的促黄体生成素、促卵泡激素（FSH）等。,金免疫测定应用,（3）心血管病：急性心肌梗死的标志物：肌酸激酶的同工酶C
10、K-MB，肌红蛋白，肌钙蛋白-T及脂肪酸结合蛋白质（PABP）等；与心血管疾病有重要关系的D-二聚体（D-dimer） （4）肿瘤：肿瘤标志物如前列腺特异抗原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的大便潜血免疫检测（FOB）等 （5）自身免疫病：抗双链DNA抗体和诊断甲状腺自身免疫病的甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体,金免疫测定应用,（6）毒品检测：尿液中的可卡因、大麻、吗啡、海洛因、苯丙胺等。国外报道有可同时测7种毒品的GICA。（7） 其它检测：C-反应蛋白，半定量检测血清-脂蛋白。2. 非临床应用： 可用于食品检测，环境污染，生物沾染，还可用于生
11、物战剂的快速检测，兽医学及法医学等方面检测。,金免疫测定的重点和展望,临床应用的重点应放在（1）急需快速诊断以便进行治疗的急重症，如协助确诊急性心肌梗死的急性心梗标志物。（2） 有普查意义的检查和流行病学调查：如各种传染病（病毒性肝炎，艾滋病，性病及其它各种流行病）流行病调查；（3）某些肿瘤（如前列腺癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌）的普查及预防检查；（4）围产期的健康普查等。（5）作为快速的初筛普查手段，对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可靠的检查。,金免疫测定今后的发展,(1)全面提高质量。突出质量控制的保证。 (2)提高检测的灵敏度。目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫分析，应尽量缩小差距。除使
12、用各种优质的原料，如膜条，高纯度高亲和力的配体（特别是配伍好的优质单抗），优质高比度的标记配体以及先进的工艺外，还应引进信号放大系统，例如生物素-链亲和素系统，应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数，可明显提高灵敏度。,金免疫测定今后的发展,(3)实现半定量和定量化。 (4)检测多种分析物。同一个膜上可同时测定几种有相关意义的分析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗体。(5)建立检测全血的方法。主要针对急重症快速诊断之用，以减少分离血清的时间。德国宝灵曼生产的人肌钙蛋白GICA便采用全血检测方法。检测全血的方法对自检，患者床旁检查和边远地区的普查都有实际应用意义。,第三节,其他膜免疫测定技术
13、,一、斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA,二、酶联免疫斑点试验 ELISPOT,20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot , ELISPOT)。,ELISPOT 检测原理,细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 ELISPOT 酶联斑点分析
14、系统对斑点的分析后得出结果。,ELISAPOT,ELISPOT结果判断,三、免疫印迹法 Western blot,将凝胶电泳与固相免疫测定结合起来，将经电泳分区的蛋白质精确且近似定量地转移到固相载体上如硝酸纤维素膜(NC膜)，并保持其原有的生物活性，再经荧光免疫、酶免疫、放射免疫技术等进行测定，可得以定位、定性和定量结果。实质上分3步骤，即：蛋白质组分分离、各组分转印及免疫检测。,免疫印迹法,操作步骤,1.蛋白质分离 采用聚丙稀酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electrophoresis, PAGE)进行分离。2.蛋白质转印 从凝胶上将蛋白质转移至NC膜 等固相载体的过程即为蛋白质转印。 3.蛋白质的免疫检测 将已转印NC膜封闭，用酶免疫组化技术、免疫金组化技术等检测。,应用举例用免疫印迹法检查患者血清中的HIV病毒抗体,凝胶,NC膜,转移,4.加入标记抗人Ig,方法评价,免疫转印技术综合了PAGE的高分辨力和免疫标记技术的高度特异性和敏感性。PAGE具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应，使之具有高度的分辨力，在同一固相载体上可作多项成分的分析。随着这种固相反应基质商品化，该技术会越来越广泛地应用到医学检验工作中。,
