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1、眉题2 啤酒酵母ECM25/YJL201W基因敲除对啤酒风味稳定性的影响张一心, 李崎, 沈微, 谢焱, 顾国贤江南大学工业生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122摘 要: 以pUG6为模板, 设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物, 构建了带有卡那抗性基因(kanMX)破坏盒, 转化啤酒酵母G-03, 获得一株G-03/a转化菌, 遗传稳定性良好, 测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。有氧条件下11oC和28oC培养时转化菌G-03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)分泌量在对数生长期分别比原菌高21.4%和14.7%。在锥形瓶中连续发酵4代后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发
2、酵液、成品酒中GSH含量分别提高32.1%和13.8%, 发酵液和成品啤酒SI系数分别提高7.7%和5.3%, 成品啤酒RSV值提高45.0%。EBC管发酵6 d后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液中GSH含量提高34.0%。转化菌G-03/a与G-03所酿制成品啤酒的常规指标没有显著差别。表明G-03/a是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母, 能够提高啤酒的风味稳定性。关键词: 啤酒酵母, 基因敲除, ECM25, 谷胱甘肽, 分泌, 啤酒风味稳定性Effects of Knockout ECM25/YJL201W Gene in Brewing Yeast on Beer Flav
3、or StabilityYixin Zhang, Qi Li, Wei Shen, Yan Xie, and Guoxian GuThe Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, ChinaAbstract: The ECM25 deletion mutant of industrial brewing yeast, G03/a, was constructed by replacing the ECM25 gene with the
4、kanMX gene. The transformant was verified to be genetically stable. The PCR analysis showed that ECM25 gene in the G-03/a was deleted. Under aerobic conditions of 11oC and 28oC, compared with the host strain G-03, the excretive glutathione concentration of G-03/a increased by 21.4% and 14.7%, respec
5、tively. Strains G-03 and G-03/a were inoculated in flasks and cultivated continuously for 4 generations. Compared with the host strain G-03, the glutathione concentration in the main fermentation broth and final beer of strain G-03/a increased by 32.1% and 13.8%, the stability index (SI) increased b
6、y 7.7% and 5.3%, respectively, and the flavor resistance staling value (RSV value) in final beer increased by 45.0%. During EBC fermentation, the glutathione concentration in the main fermentation broth of strain G-03/a increased by 34.0%, compared with the host strain G-03. Furthermore, no signific
7、ant difference in routine fermentation parameters was found. The strain G-03/a is proved to be an excellent anti-staling brewing yeast to improve beer flavor stability.Keywords: brewing yeast, gene knockout, ECM25, glutathione, excretion, beer flavor stabilityJ张一心等: 啤酒酵母ECM25/YJL201W基因敲除对碑酒风味稳定性的影响1
8、427风味稳定性作为啤酒的重要质量指标之一, 从20世纪70年代开始就受到国外学者的关注1,2。啤酒酵母是啤酒生产的灵魂, 是对啤酒风味和风味稳定性具有决定作用的因素之一。啤酒是非常复杂的体系, 其中有些化合物会通过一系列反应, 使啤酒风味不断变化, 最终导致风味老化。但是啤酒酵母会产生一些具有抗老化功能的还原性物质, 如还原型谷胱甘肽(GSH)、亚硫酸盐和还原酮等, 它们都能协助消除氧自由基的积累。此外, GSH也能防止酿造酒色泽改变和香气损失并有抑菌的作用3。ECM25基因位于酵母X号染色体, 可能和细胞壁生物合成、结构及蛋白质运输相关4-6。Perrone等已经发现, 酵母ECM25基因
9、的缺失, 或液泡蛋白质分选等基因的缺失, 会影响GSH的运输途径, 从而改变GSH的内稳态并导致其过量分泌7-9, 但是这些菌株通常只是用于实验室研究的营养缺陷型, 而工业啤酒酵母是野生型菌株, 且没有关于工业啤酒酵母ECM25基因缺失和胞外分泌GSH的报道。啤酒生产时酵母合成和分泌的GSH可以显著延长啤酒的风味保鲜期10-12。本次研究主要是对一株工业啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)G-03通过同源重组, 以卡那抗性基因替换, 敲除ECM25基因, 获得了一株GSH分泌量增加的抗老化啤酒酵母菌株G-03/a。摇瓶发酵结果表明, 转化菌酿制啤酒的风味基本保持
10、不变, GSH分泌量增加, 成品啤酒的风味稳定性提高。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种和质粒啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis)MI4, 是前期研究以青岛啤酒酵母青为出发菌株通过蛋氨酸连续驯养得到的GSH合成能力提高的啤酒酵 母10, 啤酒酵母(S. carlsbergensis) G-03, 大肠杆菌JM109和DH5a为本实验室保存。质粒pMD-18T购自TaKaRa公司。pUG6为本实验室保存。1.1.2 主要试剂2-苯叔丁基硝酮(PBN 纯度为98%), 聚乙二醇3350 (PEG 3350), 单链载体DNA(来自沙门氏试验中型脱氧核酸钠盐)
11、均购自Sigma公司。二苯代苦味酰肼自由基(DPPH 纯度为90%)购自东京工业株式会社, PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和DNA marker购自上海生工生物工程技术服务有限公司, Taq DNA聚合酶、dNTP购自上海博彩生物科技有限公司。引物由上海生工合成(表1)。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。1.1.3 培养基麦汁培养基: 实验室全麦芽自制(11P), 酒花添加量为0.4 g/L。YPD培养基: 酵母粉10 g/L, 蛋白胨20 g/L, 葡萄糖20 g/L; 若为筛选培养基, 加入G418, 使其在培养基中的终浓度为200 mg/L。1.2 方法1.2.1 破
12、坏盒的构建以pUG6为模板, Pecout01、Pecout02为引物, PCR循环参数为: 94oC, 5 min; 30个循环: 94oC, 40 s, 56oC, 90 s, 72oC, 2 min; 72oC, 12 min; 4oC保温。取3 mL PCR产物用于1%的琼脂糖凝胶电泳。将得到的破坏盒, 40管合并为1管(2000 mL), 用酚及酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提后, 用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA, 再用70%乙醇洗涤2次, 空气中干燥后, 将沉淀溶于50 L的1TE buffer。表1 PCR介导基因破坏引物和验证引物Table 1 Oligo nucle
13、otides used in PCR-mediated gene disruption and verificationPrimersSequence (53)For gene knock outPecout01TCGACTTATTTGCCAGCATCTGATGAAATTGGCGATAGGTCGACAACCCTTAATATAACPecout02TAGCCTGCTAACCTTGTTGCTTGCTTTAATATCTGGTGGATCTGATATCACCTAATAACFor PCR verificationPkanT02TTCCATAGGATGGCAAGATCPecmT02TCTTTGTGGACTAG
14、GGCTTCPecm01ATGATAGATATCAACGTTAATAACPecm02TTACCACCTTTGTTTCATTTCATTC1.2.2 啤酒酵母感受态的制备、转化及筛选啤酒酵母感受态的制备和转化见文献13。在含G418终浓度为200 mg/L的YPD平板上涂布筛选转化子, 培养57 d后, 将长出的酵母在G418平板上再划线一次, 得到单菌落。1.2.3 基因组DNA提取及转化菌的鉴定基因组DNA的提取见文献13, 使用表1的引物进行PCR验证, PCR循环参数为: 94oC, 5 min; 30个循环: 94oC, 40 s, 50oC, 90 s, 72oC, 2 min; 72
15、oC, 12 min; 4oC保温。取3 mL PCR产物用于1%的琼脂糖凝胶电泳。1.2.4 转化菌的遗传稳定性将转化菌在YPD斜面上连续移接10代, 将10代转化菌在含200 mg/L G418的YPD平板上划线。将第3代、5代、7代、10代转化菌接种于YPD液体培养基, 180 r/min培养1 d, 收集细胞, 提取基因组DNA, 以酵母基因组DNA为模板, PCR验证。1.2.5 低温发酵(1) 锥形瓶发酵: 斜面菌种经扩培, 接种于含有300 mL麦汁的锥形瓶中, 于11oC低温培养箱中进行主发酵, 发酵6 d后, 主发酵结束, 取部分发酵液过滤测定各项理化指标及老化指标, 其余装
16、瓶4oC后发酵10 d, 进行感观品评并测定RSV值。(2) EBC发酵: 斜面菌种经扩培, 接种于含有 300 mL麦汁的锥形瓶中, 充分振荡后加入2.5 L麦汁, 倾入EBC发酵管。第1天 10oC, 26 天 11oC主发酵, 每天取样测定发酵液中GSH及酵母胞内GSH。1.2.6 发酵液中GSH浓度四氧嘧啶法测定发酵液中的GSH14。1.2.7 酵母胞内GSH含量先将酵母细胞用蒸馏水洗涤2次后置于-20oC冷冻后煮沸15 min, 然后在浓度为40%(V/V)的乙醇溶液中30oC下振荡抽提2 h, 测定上清液GSH浓度, 除以相应细胞干重得到胞内GSH含量。1.2.8 羰基化合物含量(
17、TBA值)用以二烯醛类为代表的羰基化合物浓度来表 征啤酒或麦汁中老化物质的含量15。取5 mL经 10 000 r/min离心的麦汁或啤酒样品, 加入2 mL含0.33%硫代巴比妥酸的50%乙酸溶液, 充分混合, 于60oC水浴中加热60 min, 冰浴速冷。以5 mL离心后麦汁或啤酒样品加2 mL蒸馏水为空白, 530 nm下比色, 以吸光度表示TBA值。1.2.9 分光法测定DPPH清除率DPPH溶液配制: 准确称取20 mg DPPH, 用无水乙醇溶解并定容至250 mL。测定: 样品稀释20倍后取2 mL待测液及2 mL DPPH溶液置于一具塞试管中, 混匀, 30oC水浴避光放置60
18、 min, 以无水乙醇为空白于517 nm测其吸光度Ai, 并以下式计算清除率16:式中: Ac: 2 mL无水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度; Ai: 2 mL待测液加2 mL DPPH溶液的吸光度; Aj: 2 mL待测液加2 mL无水乙醇的吸光度。1.2.10 电子自旋共振(ESR)法测定啤酒(发酵液)中的自由基将0.5 mL除气啤酒(发酵液)装入离心管, 外覆铝箔避光, 加入PBN溶液10 mL, 使其终浓度达到2.55 mol/L, 混匀; 置于60oC水浴中, 促使自由基产生, 此过程称为培育, 定时取样测定。PBN溶液配制: 451.98 g PBN/L, 溶剂为50%乙醇
19、-水(V/V)。ESR测定条件: 中心磁场3475.00 G; 微波功率4 mW; 微波频率9.7 GHz; 调制频率200 kHz; 调制幅度2.00 G; 温度室温; 扫描时间3 min17。1.2.11 啤酒风味保鲜期的预测取同一批次的5瓶啤酒, 其中1瓶对照样品置于冰箱中保存, 另4瓶置于60C水浴中陈化, 每12 h取出1瓶陈化啤酒放于冰箱中保存。待4个样品全部陈化好后, 同1.2.8操作, 以对照为空白, 530 nm下测定不同陈化时间下样品的吸光度, 即为TBAt值。风味保鲜程度(Resistance staling value , RSV)以下式表示18不同新鲜啤酒样品的RSV
20、值与啤酒的风味保鲜期基本呈线性关系。1.2.12 细胞大小、死灭温度、生长曲线、絮凝力、麦汁浓度、酒精浓度、发酵度、-氨基氮等常规参数参见文献19。2 结果与分析2.1 ECM25的克隆和序列分析提取G-03染色体组DNA, 用Pecm01和Pecm02扩增出ECM25, 胶回收后连接pMD-18T, 送上海生工测序, 全长为1.8 kb(GenBank Accession No. EU328157)。序列分析表明, G-03 ECM25的核苷酸序列与S. cerevisiae Z49476和AY692747 (Bakers yeast)的ECM25的同源性为99%。根据序列设计基因破坏引物P
21、ecout01和Pecout02。2.2 基因破坏盒ECM25-kanMX-ECM25的构建及啤酒酵母的转化以含有kanMX的质粒pUG6为模板, Pecout01和Pecout02分别在5端带有与ECM25同源的36 bp和35 bp, 并分别在3端带有与kanMX同源的23 bp和24 bp。PCR产物1649 bp(图1), 与预计片段大小相符。图1 SFH-PCR构建破坏盒Fig. 1 PCR-Synthesis of disruption cassettes with small flanking homology (SFH-PCR)M: marker (lDNA/EcoR I+Hi
22、nd III); 1,2: disruption cassettes将40管破坏盒(2000 mL)纯化后, 醋酸锂法转化啤酒酵母G-03, 在含200 mg/L G418的YPD平板筛选转化子。使该基因片段的两端与ECM25发生同源重组, 从而达到破坏ECM25的目的(图2)。将在G418抗性平板上生长出的菌落划线分离, 获得单菌落命名为G-03/a。2.3 转化菌的验证及遗传稳定性转化子DNA水平上的鉴定先采用PCR来验证。提取转化菌G-03/a的染色体DNA, 以G-03/a染色体DNA为模板, 引物先使用表1中的Pecm01和Pecm02对其PCR, 电泳显示获不同分子量的两条扩增条带
23、, 但是以原菌G-03染色体DNA为模板的PCR只出现了一个条带(图3)。图2 啤酒酵母工程菌的构建Fig. 2 Construction of the recombinant industrial brewing yeast图3 使用Pecm01, Pecm02验证转化菌G03/aFig. 3 Detection of gene deletion events by PCR analysis using Pecm01 and Pecm02M: marker (lDNA/EcoR I+Hind III); 1: PCR product of G-03; 2: the negative cont
24、rol; 36: PCR products of G-03/a 由于转化菌G-03/a在G418抗性平板上生长, 说明至少有一个ECM25等位基因已经被kanMX替代, 而原菌G-03具有完整的ECM25。根据上述情况, 设计Pecm01、PecmT02和Pecm01、PkanT02两对引物(表1)进行再次验证(图4)。结果表明, 原菌内部没有抗性基因(Lane3), 转化菌内部具有抗性基因(Lane 4), 由于工业啤酒酵母为多倍体, 转化菌可能只敲除了多倍体酵母中的一个ECM25等位基因 (Lane 2), 可能至少还有一个完整的ECM25基因。图4 转化菌基因敲除的验证Fig. 4 De
25、tection of gene deletion events by PCR analysis1, 3 and 2, 4 were the results of G-03 and G-03/a, respectively. The primer for 1 and 2; 3 and 4 were Pecm01-PecmT02; Pecm01- PkanT02, respectively. M1: marker (lDNA/EcoR I+Hind III), M2: marker D为进一步确认上述推测, 将图3中PCR后电泳显示的2条带胶回收, 连接pMD-18T后转化大肠杆菌JM109, 送
26、上海生工测序, 测序结果表明转化菌中一个ECM25等位基因已被kanMX替代(结果未显示), 可见转化子已经成功敲除了一个ECM25基因。将移接10次的转化菌在含200 mg/L G418的YPD平板上划线(图5), 表明其遗传稳定性良好。图5 转化菌的遗传稳定性Fig. 5 Genetic stability assayG-03/a: after 10th generations of culture transferring. A: YPD plate with G418 (200 mg/L), B: YPD plate2.4 转化菌G-03/a、原菌G-03和MI4在11oC和28oC下
27、有氧生长及胞内外GSH含量由于啤酒酵母的最适生长温度为28oC, 而主发酵过程的温度为11oC, 故选取这两个温度点, 在有氧生长条件下, 比较转化菌G-03/a、原菌G-03和MI4胞内外GSH含量。摇瓶结果如图6和图7所示。可以看出, 和原菌相比, 在11oC下转化菌G-03/a在对数生长期中期(13.5 h)的胞外GSH含量提高21.4% (P0.01), 在28oC下转化菌在对数生长期中期(7 h)的胞外GSH含量比原菌提高14.7% (P0.01)。这是因为啤酒酵母在28oC下生长代谢旺盛, 虽然在迟滞期胞外GSH含量较高, 但是一些老化物质的前驱物质的产生能力和氧自由基得到加强,
28、导致对数生长期胞外GSH含量较低。通过蛋氨酸连续驯养得到的GSH合成能力提高的MI4 (图7), 胞外GSH含量在对数生长期却没有转化菌G-03/a高, 这表明, ECM25基因的图6 在11oC和28oC下啤酒酵母有氧生长的胞外GSH含量Fig. 6 The extracellular GSH content of brewing yeast under different tempraturesA: propagate temperature 11oC; B: propagate temperature 28oC; : G-03; : G-03/a; : MI4图7 在11oC和28oC下
29、啤酒酵母有氧生长胞内GSH含量Fig. 7 The intracellular GSH content of brewing yeast under different tempraturesA: propagate temperature 11oC; B: propagate temperature 28oC; G-03; G-03/a; MI4敲除可以在细胞对数生长期提高GSH的分泌量, 且在主发酵温度11oC下, GSH的分泌更为有利。但是啤酒发酵过程中, 啤酒酵母在大部分时间处于厌氧环境, 转化菌是否会提高啤酒的风味稳定性, 是否会改变其他的发酵性能？2.5 转化菌G-03/a和G-0
30、3、MI4的性能比较2.5.1 转化菌G-03/a和G-03、MI4的生理性能的比较啤酒酵母是一个具有精密调控体系的真核生物, 所以ECM25基因的敲除可能会导致其生理性能的改变。从表2中可以发现, 和原菌G-03相比, 转化菌G-03/a的死灭温度有了变化, 絮凝值和a-氨基氮同化率则分别下降了5.4% (P0.05)和8.3% (P0.05)。表2 啤酒酵母G-03、MI4和G-03/a生理性能比较Table 2 Comparison of the physiological performance of strains G-03, MI4 and G-03/a (mean SD, n=3
31、)StrainG-03MI4G-03/aLethality temperature (oC)535252Flocculation value (%)70.71.0868.21.1466.91.85Alfa amino nitrogenAssimilation value (%)48.40.5643.90.7644.40.61表3 低温发酵常规指标1Table 3 Fermentation routine parameters of the different strains1 (mean SD, n=3)StrainG-03MI4G-03/aOriginal extract (W/W, %)1
32、1.270.7011.710.4910.540.31Ethanol (W/W, %)4.480.184.710.174.510.14Apparent fermentationdegree (%)76.21.7376.01.7374.00.89Fermentation degree (%)60.31.3259.81.5957.31.561 Data represents mean value of three samples after main fermentation, which are 1st generation, 2nd generation and 3rd generation r
33、espectivelySI (Stability index)系数能很好反应啤酒的风味稳定性, 它不仅适用于同一品牌啤酒, 也适用于不同的啤酒酵母所酿制的啤酒风味稳定性评价, 具有很强的实用价值22。转化菌G-03/a所酿主酵液的SI系数分别比G-03和MI4高7.7% (P0.05)和1.7% (表4)。主酵后, 转化菌G-03/a胞外GSH含量分别比G-03和MI4高32.1% (P0.05)和6.9%。主酵液的ESR曲线如图8所示。与原菌G-03曲线相比, G-03/a的曲线上升趋势先慢后快, 表明主酵液中存在快速的还原剂, 这可能是由于GSH与自由基发生反应, 使得在培育初期的自由基清
34、除, 而MI4所酿制的主酵液中存在作用缓慢的抗氧化剂, 可能是由于其胞内GSH在培育后期释放而使得曲线后期近零增长。成品啤酒中MI4的SI系数比G-03高8.0% (P0.05), 比G-03/a高2.6%, G-03/a的SI系数比原菌G-03高5.3% (P0.05) (表4)。成品啤酒中G-03/a胞外GSH含量比G-03高13.8% (P0.05), 但是却比MI4低7.9% (P0.05)。成品啤酒的RSV值MI4比G-03提高98.3% (P0.01), 比G-03/a提高36.8% (P0.01), G-03/a的RSV值比原菌G-03提高45.0% (P0.01)。由于MI4是
35、胞内合成GSH能力得到加强的啤酒酵母, 虽然在主酵后其胞外GSH含量比G-03/a少, 但在10 d的后酵过程中, 可能由于酵母自溶或其他一些原因, 其胞内的GSH缓慢的分泌出来, 从而使得在成品啤酒中MI4胞外GSH含量和SI系数及RSV值均高于G-03/a。这也表明, 胞内合成GSH能力强的啤酒酵母可能比分泌型啤酒酵母对啤酒风味稳定性有更高的贡献。而和原菌G-03相比, 转化菌G-03/a主酵后SI系数、胞外GSH含量, 成品啤酒SI系数、胞外GSH含量和RSV值都得到提高。经品尝, 转化菌G-03/a与啤酒酵母G-03酿制的啤酒风味基本一致。按照1.2.5 (B)的方法进行EBC发酵,
36、主酵期间每天取样, 测定啤酒酵母细胞内和发酵液中GSH的含量。图9显示, 随着发酵过程的进行, 胞内GSH含量逐步增加并恒定, 发酵液中GSH含量逐步减少。这可能是因为随着发酵过程的进行, GSH延缓了自由基反应和一些老化物质的前驱物质的产生而自身消耗了一部分。第6天主酵结束时EBC管中发酵液的GSH含量G-03/a比G-03高34.0% (P0.01)。表4 低温发酵主要老化指标1Table 4 Fermentation major staling parameters of the different strains1 (mean SD, n=3)StrainG-03MI4G-03/aSI
37、 of fresh beer2185.915.87196.815.84200.25.80Extracellular GSHof fresh beer216.51.3120.41.3121.81.54SI of final beer3213.965.43231.134.59225.213.41Extracellular GSHof final beer326.81.3033.11.1030.51.19RSV of final beer3100.39.0198.910.2145.49.01 Data represents mean value of three samples, which are
38、 1st generation, 2nd generation and 3rd generation respectively2 Dates were analyzed after main fermentation3 Dates were analyzed after secondary fermentation图8 主酵液的ESR自由基生成曲线Fig. 8 Free radical generation course after main fermentation: G-03/a; : MI4; : G-03图9 EBC发酵过程中啤酒酵母胞内及胞外GSH含量Fig. 9 The intra
39、cellular and extracellular GSH content during EBC fermentation: Intracellular GSH content of G-03; : Intracellular GSH content of G-03/a; : Intracellular GSH content of MI4; : Extracellular GSH content of G-03; : Extracellular GSH content of G-03/a; Extracellular GSH content of MI43 讨论啤酒酵母工业菌株一般为多倍体
40、菌株, 本实验由G-03敲除了一个ECM25等位基因的转化菌G-03/a是一株遗传性状稳定的优良啤酒酵母。和原菌相比, 转化菌能分泌较多的GSH, 可以降低啤酒中老化前驱物质和老化物质的浓度, 因此提高了啤酒的抗老化能力, 使成品啤酒的风味稳定性得到显著改善。但是用于基因破坏的kanMX对于啤酒酵母是一个外源基因, 因此转化菌还需要对其进行敲除才可以用于实际生产。啤酒酵母是一个具有精密调控体系的真核生物, 谷胱甘肽的分泌可能还和酵母的絮凝、膜流动性和透性、氨基酸、脂肪酸、酒精胁迫、pH胁迫、氧胁迫等存在更为复杂的调控机制, 该设想还有待进一步证实。REFERENCES1 Hashimoto N
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