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1、摘 要酿酒酵母是一种传统的乙醇生产微生物，通常用于乙醇燃料生产和酿造业，但过量的乙醇会抑制细胞的生长和活性，对酵母细胞产生毒害作用。ROS（Reactive Oxygen Species）是一类性质活泼的小分子化合物，在多种逆境胁迫中期起重要作用，但是否在乙醇胁迫中起重要作用尚无定论。为了解ROS在乙醇胁迫中的作用及机制，本文以酿酒酵母为材料，检测了乙醇胁迫对酵母细胞超氧阴离子（O2-）含量、过氧化氢（H2O2）含量、酵母细胞生长状况、膜完整性、线粒体膜电位以及脂质和蛋白质损伤的影响。实验结果表明，乙醇可以抑制对数生长期酵母的生长，导致膜完整性受损、线粒体膜电位降低、O2- 和H2O2水平增加
2、、脂质过氧化物MDA含量增加。加入外源还原型谷胱甘肽（GSH），蛋氨酸（Met），N-acetylcysteine（N-乙酰半胱氨酸，NAC）后，可以提高酿酒酵母细胞存活率及膜完整性，线粒体膜电位、降低O2- 和H2O2水平。添加GSH，Met，NAC到发酵培养基中，检测发酵后乙醇含量发现，正常组为7.3%，Met，NAC可以将乙醇产率分别提高到8.62%和8.56%，而GSH只有6.35%。以上结果表明乙醇能够诱导O2- 和H2O2等ROS的产生，导致氧化胁迫，从而造成酵母细胞发生膜质过氧化，生长受到抑制。而GSH，Met，NAC可以清除过量的ROS，降低乙醇胁迫引起的酵母损伤，其中Met和
3、NAC虽然可以提高乙醇产率，但是只有NAC处理在统计学上具有差异性。为进一步研究ROS变化的机制，采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)处理乙醇胁迫条件下的酵母细胞，检测对O2- 和H2O2水平，菌落形态以及膜完整性的影响。结果表明，3MA可以有效降低O2- 和H2O2水平，降低乙醇对酵母菌落的抑制，提高膜完整性，而雷帕霉素进一步加剧对菌落的抑制，降低膜完整性，提高O2- 和H2O2水平。表明自噬是影响ROS水平的机制之一，它通过调节ROS参与酿酒酵母乙醇胁迫损伤。关键词：酿酒酵母；乙醇胁迫；自噬；ROS Abstract Saccharomycescerevisia
4、e is a strain used to produce ethanol and is applied in the production of ethanol fuel and brewing industry.Saccharomycescerevisiae is a tranditional yield ethanol strain, but is sensitive to the high concent of ethanol. Excessive accumulation of enthanol could inhibit the growth and activity of cel
5、ls, induce reactive oxygen species，thereby lead to a damage to yeast cells. Autophagy is an important degradation pathway for maintaining the balance and matter cycle in eukaryotic cells. Although we have a certain amiynt research on ethanol stress, the mechanism of ethanol stress in Saccharomycesce
6、revisiae, which ROS plays a leading role under ethanol stress, whether autophagy is involved in ethanol strees and what role autophagy has in ethanol. The above problems are not yet clear. To understand which ROS has an important role in ethanol stress, Saccharomyces cerevisiae from Angel Yeast was
7、as the experimental material in this work, we studied the effect of reactive oxygen species (ROS) on Saccharomyces cerevisiae growth and fermentation under ethanol stress, through detecting physiological indicatiors including cell growth, the membrane integrity, superoxide anion(O2-) conctent, hydro
8、gen peroxide (H2O2)content, malondialdehyde(MDA), carbonyl content and so on. The result showed that ethanol could inhibit the growth of yeast cells in the logarithmic phase, damage the membrance integrity, rise the levels of O2- and H2O2 , increase the content of MDA (the product of Lipid peroxide)
9、. We used exogenous Glutathione (GSH), Methionine (Met) and N-acetylcysteine (NAC) treated ethanol stressed Sacchayomycescerevisiae respectively, and found that they could reduced the level O2- and H2O2, increased cells activity and decreased the concent of MDA. This indicates tha ethanol couldinduc
10、e the generation of O2- and H2O2, leding to the oxidative stress, resulting in the damage to yeast cells. When the growth inhibited serious, ethanol even could lead to the death. GSH and Met, NAC could clear the excess of ROS, reduce the yeast damage caused by ethanol stress and improve the ethanol
11、yield.In order to understand whether autophagy was involved in the ethanol stress in the S. cerevisiae as well as it was related with ROS, we used 3-MA (autophagy inhibitor) and rapamycin (autophagy inducer) to treat ethanol-stressed Saccharomyces cerevisiae, the membrane integrity was by PI stainin
12、g, the level of O2- and H2O2 was detected by ROS fluorescent probe DHE and DCFH-DA staining. The results showed that 3-MA could reduce the inhibition of ethanol on yeast cells, improve the membane integrity, reduce the levels of O2- and H2O2. But rapamycin could further deepen the colony inhibition,
13、 reduce the membrane integrity, improve the levels of O2- and H2O2. This indicates that autophagy involves in Saccharomyces cerevisiae ethanol stress by regulating the level of ROS, and plays a role of maintaining cell survival in ethanol-stressed Saccharomyces cerevisiae.Key words: Saccharomycescer
14、evisiae；ethanol stress；autophagy；ROS缩略词英文缩写英文全称中文名称BSABovine serum albumin牛血清白蛋白CvtCytoplasm to vacuole targeting细胞质到液泡途径DAB3, 3-Diaminobenzidine,tetrahydrochloride 3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐DCFH-DA2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate2，7-二氯荧光素二脂DHE Dihydroethidium 二氢溴化非啶DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜DNPH2,4-Di
15、nitrophenylhydrazine2,4-二硝基苯肼EDTAEthylenediamine tetracetic acid乙二胺四乙酸GSHGlutathione谷胱甘肽MetMethionine蛋氨酸3-MA3-Methyladenine3-甲基腺嘌呤NACN-acetylcysteineN-乙酰半胱氨酸NBTNitroblue tetrazolium 氯化硝基四氮唑蓝O2-Superoxide anion超氧阴离子PASThe phagophore assembly site 自噬体组装位点PBSPhosphate buffer solution磷酸缓冲液PMSFPhenmethyl
16、 sulfonyl chlorine苯甲基磺酰氯ROSReactive oxygen species活性氧rpmRounds per minute每分钟转速SAMS-Adenosylmethionine,腺苷蛋氨酸SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠TBA2-Thiobarbituric acid硫代巴比妥酸TCATrichloroacetic acid三氯乙酸Tris2-AminoAmino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol 三羟甲基氨基甲烷Triton-X-100Triton-X-100曲拉通100目录第一章 前 言11.1 乙
17、醇对酵母的影响11.1.1乙醇对酵母的毒害作用11.2 活性氧21.2.1 活性氧的危害31.2.2常见抗氧化剂ROS防御系统41.3 自噬61.4研究内容及目的、意义7第二章 材料与方法82.1 实验材料、仪器和试剂82.2实验主要试剂92.2.1 实验所用培养基配方92.2.2 蛋白含量测定试剂配方102.2.3荧光试剂配制102.2.4自噬相关试剂配制112.3 实验方法112.3.1 生长情况检测112.3.2 粗裂解酶液的制备122.3.3 点菌落实验122.3.4总蛋白含量测定122.3.5 存活率测定132.3.6 酒精含量测定132.3.7膜完整性测定142.3.8 H2O2含
18、量测定142.3.9 O2-含量测定（DHE法）152.3.10 O2-含量测定（NBT法）152.3.11膜脂过氧化水平测定152.3.12线粒体膜电位检测15第三章 结果与分析173.1 乙醇对酿酒酵母生长发育的影响173.2乙醇胁迫对酿酒酵母细胞膜完整性的影响183.3 GSH、Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母的影响193.3.1对乙醇胁迫酿酒菌落形态的影响193.3.2对乙醇胁迫酿酒酵母细胞膜完整性的影响203.3.3对乙醇胁迫酿酒酵母线粒体膜电位的影响223.3.4对乙醇胁迫酿酒酵母中ROS的影响243.3.5对乙醇胁迫酿酒酵母中MDA含量的影响283.3.6对乙醇胁迫酿酒酵母中乙醇
19、产率的影响.283.4自噬在乙醇胁迫中的作用293.4.1自噬对酵母菌落形态的影响.293.4.2自噬对膜完整性的影响323.4.3自噬对ROS的影响333.5 讨论353.5.1 ROS增加是乙醇胁迫抑制酿酒酵母生长的主要原因353.5.2 Met可以恢复乙醇对酿酒酵母的损伤363.5.3 自噬通过减少ROS降低乙醇胁迫损伤36第四章 结论37参考文献38致谢41个人简历43第一章 前 言1.1 乙醇对酵母的影响酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种重要的工业微生物，由于其在发酵工业中的广泛应用，导致国内外很多学者将其对环境胁迫因素的反应作为研究重点1，而提高酿酒
20、酵母对环境胁迫因素的耐受性对食品，酿酒等工业的生产具有重要的实际意义。近年来，以燃料乙醇为代表的生物能源生产受到全球的关注，其中燃料乙醇作为可再生的情节能源，已经率先实现了大规模的工业化生产和应用。而乙醇是酵母菌发酵糖的重要产物之一，虽然酵母具有较高的乙醇耐受力和乙醇产率，但是当乙醇在培养基中的浓度超过一定值时，就会对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强烈的抑制作用，严重时甚至导致细胞死亡。在发酵过程中，使用酿酒酵母酿酒或者生产燃料乙醇，都会涉及到乙醇的积累对酵母细胞的毒害作用，从而使得乙醇的产量受到限制2。酵母菌对乙醇的耐受性受多种基因的共同调控，这与乙醇能对酵母造成多方面的损伤及毒害作用相一致。为
21、了鉴别与乙醇耐受性相关的基因，通过观察在含有不同浓度乙醇培养基上的酵母菌单基因突变体的生长发现了137个与乙醇耐性相关的基因3，而Auesukaree C等人通过对4828株酵母缺陷型菌株进行全基因筛选，发现与乙醇耐性相关的基因数目为95个4，虽然两个实验组得到的数据不同，所揭示的基因在两个报道中也是不完全一致，但是通过对缺失基因分类后发现，大部分基因都涉及到了对液泡 H+-ATPase (V-ATPase)，细胞骨架合成和细胞壁完整性等功能的可能。最近的研究结果除了肯定以往的结果以外，还发现了一些新的与酵母细胞的乙醇耐性相关的机制。1.1.1乙醇对酵母的毒害作用细胞膜 酵母菌的细胞膜是乙醇胁
22、迫时攻击的主要目标，乙醇通过增加质膜的流动性从而对正常的膜结构造成损伤。而酵母细胞可以改变膜的组成来减少膜的流动性，使质膜处于稳定状态。这说明质膜的流动性和完整性在乙醇胁迫条件下对细胞有很重要的保护作用5-6。早期的实验发现BEM2，PAT2，ROM2，VSP34 和ADA2的基因缺失突变体对乙醇和白色荧光染料都非常敏感。通过筛选酿酒酵母二倍体纯合子的缺失突变体库，发现单基因缺失的突变体URA7和 GAL6在含8% (V/V)乙醇的培养基中的生长速度明显高于野生型。URA7 编码 CTP 合成酶，主要负责磷脂的生物合成及嘧啶的从头合成。GAL6 编码氨基肽酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族。这2种缺失
23、突变体均对细胞壁溶解酶(-1,3-葡聚糖酶)的抗性增强，说明了细胞壁的完整性与其乙醇耐性相关。推测有可能是GAL6 中的热击蛋白基因 HSP12 和 HSP26 转录水平提高，导致了该突变体乙醇耐性的提高，而URA7 的乙醇耐性提高则有可能与URA7 参与磷脂的合成有关7。脂肪酸 大量实验表明，在乙醇胁迫作用下，细胞内的脂质成分发生了改变，单不饱和脂肪酸的含量明显提高。酵母的去饱和酶基因OLE1编码的是位于质膜上的去饱和酶，它可以通过氧化作用和依赖NADH的去饱和过程催化酵母中的棕榈酸(C16:0) 和硬脂酸 (C18:0)变为单不饱和脂肪酸棕榈油酸（9Z-C16:1），油酸（9Z-C18:1
24、）。You等将昆虫的膜去饱和酶基因TniNPVE插入OLE1基因突变体的基因组中。发现表达昆虫去饱和酶基因的转化子乙醇耐性最强，这个转化子在不含乙醇的YPD液体培养基中培养至对数后期时油酸产量是棕榈酸的2倍，在含有5% (V/V)乙醇的YPD液体培养基中油酸和棕榈酸产量的比例提高了4倍，这些结果表明油酸在乙醇耐性中具有重要的作用8。为了探明不饱和脂肪酸各种组成在乙醇胁迫中的作用，分别将使ScOLE1(酿酒酵母9脂肪酸脱氢酶基因)，CaFAD2 (白假丝酵母12脂肪酸脱氢酶基因)，和CaFAD3 (白假丝酵母3脂肪酸脱氢酶基因)基因在酵母中过表达。结果发现，与正常菌株相比，ScOLE1过表达提高
25、了总不饱和脂肪酸的含量和对乙醇的耐性，而过表达CaFAD2和 CaFAD3的菌株只是分别生成了亚油酸（18:2）和-亚油酸（18:3)，而不饱和脂肪酸总量和乙醇耐性都没有明显改变。这表明可能是总不饱和酸的含量而非不饱和程度在乙醇胁迫中起重要作用9。1.2 活性氧活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)是指活泼的氧自由基与具有氧自由基反应特性的其它含氧物质的总称，包括O2-、HO2、OH、H2O2、1O2、LO、LOO和LOOH，具有比氧更活泼的化学性质。好氧性微生物把氧气作为电子传递链中的的电子受体10。从电子呼吸链中泄露的电子，大概有5%会生成超氧和过氧化氢等活
26、性氧11-12。 1.2.1 活性氧的危害在正常情况下，低水平的ROS是细胞行使生物学功能所必需的，因为ROS可参与细胞内许多重要途径的信号转导调控。但在某些特殊的情况下，比如细胞自身氧化还原代谢紊乱或外界离子辐射等原因就会造成细胞内ROS的大量积聚，这种超过了细胞抗氧化防御缓冲能力的ROS可以攻击蛋白质、脂质及DNA等细胞组分而造成生物大分子的损伤，进而影响细胞的功能甚至造成细胞死亡13-15。任何有机生物体的组织在水匮乏时都能存活下来一段时间，对亲水性蛋白缺失菌株进行筛选时发现，STF2在维持细胞存活方面有重要作用16。进一步研究发现STF2基因缺失促进了ROS的积累，导致细胞凋亡。过表达
27、STF2可以减少氧化应激后ROS的积累，表明STF2p通过降低活性氧积累提高了细胞在脱水胁迫下的存活率。蛋白质损伤17 在ROS产生的部位附近的氨基酸残基、肽链、蛋白质、酶是ROS首先攻击的目标。活性氧通过对蛋白质的氧化修饰使得蛋白质构象改变，肽链断裂、聚合或交联，从而引起蛋白质功能丧失，酶和受体的功能下降，正常的生理活动受到影响。蛋白质侧链氨基酸的氧化是生命系统的一个重要信号，其侧链羰基的形成是蛋白质受到损伤的一个标志18。脂质损伤 脂质过氧化作用（Lipid Peroxidation）是自由基生物学的一个分支，是指脂类多不饱和脂肪酸（PUFA）与自由基反应，形成中间体自由基，再与分子氧化反
28、应形成脂质过氧化自由基，引起酸败作用。生物膜还有较多的多不饱和脂肪酸，由于不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，容易发生脂质过氧化，从而导致膜功能和结构的损伤19。DNA损伤 核酸同样易受ROS攻击，ROS能使DNA双链断裂和单链断裂，使DNA的碱基变成自由基，并生成稳定化合物，对核酸造成氧化性损伤。羟自由基和单线氧可以直接攻击DNA，而超氧阴离子和过氧化氢是通过产生羟自由基对DNA造成损伤的20-21。检测DNA单链或双链断裂（DNA single or double breaks, SSBs and DSBs, respectively）的程度是目前检测DNA损伤水平的主要方法2
29、2。研究已经表明，氧化损伤是引起DNA损伤的一个主要原因，在一定程度上被认为是造成SSBs and DSBs的前提因素23。在正常条件下，Yap1通过与核外运受体Crm1构成了核外运蛋白，主要存在于细胞质中。为了探明Yap1在 DNA损伤中的作用，Lori A. Rowe 等人24通过添加DNA损伤试剂MMS和UV-C（这两种试剂可以产生不同的DNA损伤且都不直接引起ROS的产生）发现，MMS处理使Yap1聚集于细胞核内，但是UV-C没有出现类似现象，检测ROS水平发现，MMS中的ROS水平高于UV-C结果表明DNA损伤通过诱导ROS造成Yap1在核内积累，而Yap1在核内的积累会上调参与BE
30、R和ROS清除途径的基因，从而激活DNA修复，预防对DNA的进一步伤害，维持细胞基因组稳定。1.2.2常见抗氧化剂ROS防御系统当酵母细胞从厌氧呼吸转换到有氧呼吸，或是暴露在H2O2以及低浓度氧化性药物中时，就会全面启动氧化防御系统，来保护胞内组分从而维持其氧化还原状态。ROS防御系统主要分为非酶类和酶类两种。1.2.2.1非酶防御系统酵母细胞中的非酶防御系统主要包括像蛋白质、氨基酸衍生物、维生素、脂肪酸、糖类和起缓冲平衡调节作用的离子等的一些小分子，它们可以从溶液中直接清除氧化产物。谷胱甘肽(glutathione, GSH)是酵母细胞中最丰富最重要的抗氧化剂分子，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘
31、氨酸三种构成的一种含有巯基的生物活性肽，在体内主要以还原态的GSH和氧化态的GSSG两种形态存在。其中GSH存在于所有生物细胞中，是机体内重要的活性物质。具有多种生理功能，主要体现在：清除自由基，保护细胞；参与氨基酸转运；解除外源性物质的毒性；参与转甲基反应，维持肝细胞正常功能；维持D N A 的生物合成，细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能等。N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）是细胞内还原性谷胱甘肽的前体，是一种含有巯基的抗氧化剂。它可以通过增加GSH含量间接发挥重要的生理功能，主要体现在：抗氧化作用；减少NO的生成；抑制炎症因子的表达；保护DNA，减轻DNA损
32、伤，抑制NDA修复相关的突变；抑制细胞凋亡等。甲硫氨酸（Met），又名蛋氨酸，以腺苷蛋氨酸（S-Adenosylmethionine, SAM）活性形式广泛存在于动物、植物和微生物体内。主要功能是参与蛋白质的合成。在生物体内Met先从ATP接受腺苷变成SAM，再进行甲基转移。如果Met缺乏就会导致体内蛋白质合成受阻，造成机体损害。体内氧自由基造成的膜脂质过度氧化是导致机体多种损害的原因。脂质过氧化会损害初级和次级溶酶体膜，是溶酶体内含有的作为水解的酸性磷酸酶释放出来，对细胞核线粒体膜等重要的细胞器造成损害，甲硫氨酸通过多种途径抗击这些损伤。1.2.2.2酶防御系统酿酒酵母中重要的抗氧化系统Im
33、portant antioxidant defence systems in Saccharamyces cerevislae酵母在适应周围的恶劣环境的过程中，已经进化出一套抗氧化防御酶系。酶防御系统不仅可以直接清除进入细胞内的各种氧化剂，修复受损的蛋白质和核酸，还可以维持非酶防御体系里起主要作用的抗氧化分子的防御水平。O2-是所有氧自由基中的第一个生成的自由基，在超氧化物歧化酶的催化作用下，可以被还原为H2O2。而H2O2又在过氧化氢酶和过氧化物酶的作用下得以清除。硫氧还蛋白过氧化物酶/硫氧还蛋白还原酶系可以将H2O2还原或烷基化，谷胱甘肽还原酶/谷胱甘肽氧化物酶系可以还原氧化态的谷胱甘肽，
34、从而维持细胞内的GSH/GSSG的比率。硫氧甲硫氨酸还原酶通过修复氧化的Met残基来保护蛋白质活性位点，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶能够修复突变的DNA。所有这些不同形式的酶体都参与了细胞抗氧化攻击。1.3 自噬自噬是真核细胞中高度保守的一个大分子降解途径，最早由Ashford等人于1962年在研究酵母时发现存在“自己吃自己”现象后提出，随着对自噬研究的进一步深入，人们发现自噬在维持细胞代谢平衡和物质循环以及压力胁迫中都起着至关重要的作用24。细胞自噬现象自二十世纪六十年代初就已发现26，但是其引起人们的重视却是在一二十年前。其大体过程是，在刺激作用下细胞生成的双成膜结构包裹住受损蛋白或细胞器形成
35、自噬小体，自噬小体进一步与液泡（酵母和植物）或溶酶体（动物）融合成为自噬溶酶体，随后内容物被降解25-26。自噬可以是非选择的，也可以是选择性的。酵母中的选择性细胞自噬主要有Cvt (Cytoplasm to vacuole targeting)途径、线粒体自噬(Mitophagy)、过氧化物酶体自噬(Pexophagy)等三种途径。Cvt途径。Cvt途径是目前研究的最透彻的选择性自噬，也是已知的唯一一个利用自噬机制为核心的生物合成途径。其主要功能是将甘露糖苷酶(Ams1)和氨肽酶(Ape1)等两种水解酶的前体定向转移至液泡中。作为酶原，Ape1以没有活性的前体PrApe1存在于细胞质中。Cv
36、t途径在自噬体组装位点（PAS，Pre-autophagygosomal structure/the phagophore assembly site）将捕获的Ape1 前体包裹进Cvt囊泡中，PrApe1首先与其受体Atg19（也叫Cvt19）结合，接着Atg11通过与Atg19 C末端结合，引导Cvt复合物定位到PAS位点。Atg19进而与Atg8-PE相互作用，促进特化的自噬体-Cvt囊泡的形成。线粒体自噬。线粒体作为细胞新陈代谢的主要细胞器，不仅是能量的提供者还是细胞内ROS主要来源。维持其正常功能对细胞有极其重要的作用。而线粒体自噬是调节线粒体数量和质量的主要途径。利用全基因组筛选线
37、粒体自噬基因缺失突变体，Tomotake Kanki等人发现Atg32是线粒体自噬的关键蛋白（但不是自噬和其他选择自噬的关键蛋白）。位于线粒体外膜上的Atg32可以作为受体与Atg11结合27。而在Cvt途径中，Atg32被 prApe1、Ams1和Atg19的复合物所代替与Atg11结合，定位于PAS( the perivacuolar phagophore assembly site)，之后再与Atg8-PE相互作用。过氧化物酶体自噬。过氧化物酶体负责脂类代谢与细胞内过氧化物的降解，其生成与降解受到严格的调控。研究过氧化物酶体自噬最常用的模式生物是生有大量过氧化物酶体的酵母Pichia p
38、astoris与Hansenula Polymorpha28。同其他两种选择性自噬一样，过氧化物酶体自噬也需要Atg11的参与。Pex14是其发生的标志性蛋白29。1.4研究内容及目的、意义 (1) 以往研究表明，乙醇导致的细胞损伤有可能是过量的ROS产生的氧化胁迫所致。但是ROS是否参与了乙醇胁迫以及具体为哪种活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中起作用并不清楚。本实验通过，通过检测酵母细胞生长状况，膜完整性，使用荧光探针DHE和DCFH-DA，特异性地检测了O2-和H2O2的水平以及检测了丙二醛（MDA）含量，乙醇产量等生理指标，研究了乙醇胁迫条件下，活性氧（ROS）在酿酒酵母菌生长和发酵过程中的作用
39、以及GSH、Met和NAC对乙醇胁迫的恢复作用。(2) 自噬在细胞存活和物质平衡方面起着重要作用，为了探明自噬是否参与了酿酒酵母乙醇胁迫，以及自噬在乙醇胁迫中起了什么作用，在乙醇胁迫中，自噬和ROS之间是否有联系，这些问题都值得深入探讨。本文以乙醇胁迫下的酿酒酵母为实验材料，分别添加自噬抑制剂和诱导剂，通过点菌落实验分析研究了自噬在乙醇胁迫中的作用。乙醇胁迫条件下，通过测定膜完整性，O2-和H2O2的水平的变化，分析乙醇胁迫下，自噬和ROS之间的关系。第二章 材料与方法2.1 实验材料、仪器和试剂（1）菌种本实验室从安琪酵母粉中提取的酿酒酵母菌（2）主要仪器设备见表2.1。表2.1 主要仪器设
40、备名称 型号 产地电子天平 岛津AY120，日本高速冷冻离心机 艾本德5804R， 德国紫外可见分光光度计 UV-1600，上海美谱达仪器公司冷冻离心机 GL-16A，上海菲恰尔分析仪器有限公司电热恒温水浴锅 DK-S24，上海精宏实验设备有限公司可调式移液器 Finnpipette，芬兰超声波细胞粉碎机 JY92-II，宁波新芝生物科技股份有限公司灭菌锅 TOMYSX-500，日本漩涡混合器 WH966，上海康华生化仪器制造有限公司荧光酶标仪 BioTeK FLX800，中国荧光显微镜 NikonTE2000-U，日本振荡培养箱 HZQ-X100，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司生化培养箱
41、PHX-150H，宁波莱福科技有限公司超净工作台 SW-CJ-1FD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司酶标仪 1020，郑州安图生物工程有限公司（1） 主要试剂见表2.2。表2.2. 主要试剂名称产地DABsigmaDCFH-DASigmaDHE SigmaGSHSolarbioHoechst33342Solarbio3-MASigmaMitotrack greenSolarbioNACSolarbioNBT SigmaRhodamine123SigmaTris Bio Basic IncTTCSolarbio牛血清白蛋白（BSA） sigma蛋白胨OxoidL-甲硫氨酸北京鼎国生物有限公司酵
42、母浸膏Oxoid考马斯亮蓝G250Solarbio 葡萄糖北京鼎国生物有限公司盐酸 洛阳昊华化学试剂有限公司乙二胺四乙酸二钠Solarbio95%乙醇 洛阳化学试剂厂2.2实验主要试剂2.2.1 实验所用培养基配方1) YPD培养基 YPD液体培养基酵母浸膏1 g蛋白胨2 g葡萄糖2 g混匀后 蒸馏水定容至 100 ml YPD固体培养基：含1%琼脂的YPD液体培养基2) 发酵培养基酵母抽提物0.75 g蛋白胨0.75 g硫酸铵 0.25 g磷酸二氢钾0.125 g硫酸镁0.25 g氯化钙0.07 g葡萄糖 25 g混匀后 定容至250 ml2.2.2 蛋白含量测定试剂配方1）考马斯亮蓝G25
43、0溶液 考马斯亮蓝G-250100 mg95% 乙醇50 ml85% 磷酸100 ml混匀后 蒸馏水定容至 1 000 ml2）1mg/ml牛血清白蛋白(BSA) BSA1 mgH2O1 ml4保存2.2.3荧光试剂配制1）5 mmol/L DCFH-DA储存液：DCFH-DA0.0012 g二甲基亚砜（DMSO）500 l使用时每1 ml细胞加4 l2）10 mg/ml DHE储存液：DHE5 mg二甲基亚砜（DMSO）500 l使用时每1 ml细胞悬浮液加4 l3）1 mg/ml PI储存液：碘化丙啶1 mgH2O1 ml使用时每1 ml细胞悬浮液加4 l2.2.4自噬相关试剂配制1）雷帕
44、霉素（rapamycin） Ethanol0.9 mlRapamycin 40 gTritonX-100 0.1 ml 使用时每1 ml细胞加50 l2）100 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）3-MA100 mg二甲基亚砜DMSO6.7 ml分装，-20下保存2.3 实验方法2.3.1 生长情况检测 本实验室从安琪酵母粉中提取的酿酒酵母。挑单菌落于YPD培养基中于180 rpm，30下培养至对数期制成种子液，按1%接种量接种于新鲜YPD培养基培养至对数期（OD=1.0）后，加入相应的试剂处理一定时间，按不同的指标测定作相应的处理。按以下不同处理设置实验，每个处理3个平行。CK：蒸馏水 5%
45、E：5%（v/v） 无水乙醇10% E：10%（v/v）无水乙醇5% E+GSH：5%（v/v）无水乙醇+2.5 mM GSH10% E+GSH：10%（v/v）无水乙醇+2.5 mM GSH5% E+Met：5%（v/v） 无水乙醇+6 mM GSH10% E+Met：10%（v/v） 无水乙醇+6 mM GSH5% E+NAC：5%（v/v） 无水乙醇+10 mM GSH10% E+NAC：10%（v/v） 无水乙醇+10 mM GSH5% E+3-MA：5%（v/v） 无水乙醇+5 mM GSH10% E+3-MA：10%（v/v） 无水乙醇+5 mM GSH5% E+Rapa：5%（v/v） 无水乙醇+10 mM GSH10% E+Rapa：10%（v/v） 无水乙醇
