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1、葡萄酒中苹果酸的测定原理:利用MegaQuantTM (专利技术)测定L-苹果酸需要进行三步酶解反应，第一步：在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)的催化作用下，L-苹果酸被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化生成草酰乙酸：(1) L-苹果酸 + NAD+ (L-MDH) oxaloacetate + NADH + H+第二步：加入过剩的L-谷氨酸，在谷草转氨酶的作用下，生成L-天门冬氨酸和2酮戊二酸(2) Oxaloacetate + L-glutamate (GOT) L-aspartate + 2-oxoglutarate第三步：在心肌黄酶的催化作用下，NADH还原碘硝基氯化四氮唑(INT)，
2、生成甲基- INT(3) NADH + INT + H+ (diaphorase) NAD+ +甲基-INT生成的甲基- INT的量取决于L-苹果酸的量，甲基- INT的吸光度值可在505nm下测量。特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度:该实验方法是专门用于测定L-苹果酸含量的。最小可调吸光光度为0.01个吸光单位，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度为7.7 mg/L。如果最小可调吸光光度为0.02吸光光度，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸检测线为15.4 mg/L。该实验的测量范围为0.15-15ug L-苹果酸(对于20uL样品液中的浓度为0.007-0.75 g/L)，同一样品
3、分别进行两次测定，其吸光度值会有0.01-0.02吸光单位的变化，对于样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度大约在7.7-15.4 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。干扰:红酒中的酚醛树脂会对本试验造成干扰，引起INT的“缓慢反应”（图2），因此在对未稀释的红酒进行测定时，必须首先用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）净化样品。“缓慢反应”同样也发生在未稀释的白葡萄酒中，按照提供的方法进行测定，其缓慢反应速率非常的慢。在用MegaQuantTM测
4、定L-苹果酸的时候，对于存在的两种潜在的次要误差原因的认可是非常有必要的：1. 使用PVPP去除了红酒中的大部分酚醛树脂，但是还是存在着 “缓慢反应”，由于用PVPP处理过的葡萄酒（导致潜在的高估白葡萄酒中的L-苹果酸0.00-0.01g/L，或红葡萄酒中的浓度0.00-0.03g/L）其中存在的“缓慢反应”非常的慢，因此可以忽略不计（实验方法A），然而，如果想得到精确的结果，可以通过实验方法B精确计算得到。2. 推荐使用PVPP药片的测试方法（如每5 mL葡萄酒用1个药片）中，导致了对样品浓度进行了2 % (v/v)稀释，计算方法中考虑了这一点（请参照用PVPP处理样品方法）还原性物质能够干
5、扰试验，引起“缓慢反应”，如：亚硫酸亚和抗坏血酸盐，但是仅仅能够对浓度不是很高的葡萄酒样品进行测定，如亚硫酸盐浓度在4 g/L，如果样品中的抗坏血酸盐含量非常高( 400 mg/L)，则不能进行测定。向已完成反应的试管中添加L-苹果酸（每20uL添加7.5 ug），通过增加的吸光度值进一步验证其他干扰的影响，利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。通过向样品中添加标准质控做定量回收试验，计算样品在处理和提取时的损失。安全性:L-苹果酸测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。试剂盒:MegaQu
6、antTM L-苹果酸含量测定试剂盒可以进行60次的测定试验，并提供有全部的试验方法：58次测定试剂盒(cat. no. K-LMALR)瓶1: 双甘氨肽缓冲液 (100 mL, 100 mM, pH10.0) +L-谷氨酸(100 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性 2年，4C保存。瓶2: 药片（60粒）-含有心肌黄酶, GOT, INT, FAD和NAD+，使用前要先恢复至室温在打开稳定性 2年，-20C;干燥保存。瓶3: L-苹果酸脱氢酶(1.3 mL, 15,000 U/mL)稳定性 2年，4C保存。瓶4: L-苹果酸质控标准液(5 mL, 0.375 mg/mL)稳定性
7、2年，4C保存。瓶5: 药片（65粒）-含有PVPP稳定性 5年，室温保存。试剂制备:1. 备用试剂盒中的瓶1溶液随时使用。每个试验用量1.5 mL，也可以同等量的蒸馏水稀释，然后每个试验用3 mL。2. 备用试剂盒中的瓶2随时使用。保存于-20C下稳定性 2年。3. 准备瓶3中的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。4. 备用试剂盒中的瓶4溶液随时使用。使用前恢复到室温，每个试验用量20uL5. 准备瓶5溶液随时使用。注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用L-苹果酸标准质控溶液进行
8、测定，通过提供的公式计算L-苹果酸的浓度。实验需要的设备:1. 检测仪中提供有特定的测试用试管(平底; 16 x 100 mm)，同时我们也提供提取用试管(cat. no. G-MQTB25)2. 10 mL聚丙烯试管3. 微量移液器(20 uL).4. 连续分配器5. 玻璃刻度移液管及吸球6. MegaQuantTM测定仪7. 定时钟注意:1. 此方法是专门用于测定经过苹果乳酸发酵的葡萄酒，如果葡萄酒中的L-苹果酸浓度 0.75 g /L，需要对样品进行稀释。 2. 稀释葡萄酒或葡萄汁必须使用纯净水（蒸馏水或高质量的水），如果使用饮用水，首先需要用D-果糖标准品验证是否适合使用。3. 测试用
9、试管使用前必须清洗干净并烘干。操作步骤:去除酚醛树脂:(对于红酒通常需要进行处理)1. 取5 mL红葡萄酒加入到10 mL的聚丙烯试管中2. 加入1片PVPP药片（瓶5），拧紧试管盖，充分混合5分钟，用Whatman No. 1 (9 cm)滤纸过滤，收集大约1 mL的滤液，滤液的颜色不能深于浅粉色（一般处理法），然而，具有深颜色的葡萄酒每5 mL需要加入2片PVPP，充分挤压收集滤液1 mL。3. 取20uL滤液进行测定A. 测试方法A. (简单法 参照图1)1. 取1.5 mL 溶液1( 23C或更高)和1.5 mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0 mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂
10、配置方法第1点）。2. 用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。3. 加入20uL葡萄酒样品经PVPP处理的(未稀释的红/白葡萄酒), 未经PVPP处理的(未稀释的白葡萄酒)或经稀释的葡萄酒或葡萄汁，充分振荡混合。4. 大约1分钟后，将试管插入到MegaQuantTM测定仪，按下开关直到屏幕上显示-（大约2秒钟）。5. 当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A1）6. 取下试管，加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。7. 再次将试管插入MegaQuantTM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示1 second,记录下数值A2
11、。8. 为了确保试剂完全反应完全，在5分钟内每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值不再变化。（参考图1和图2）注意:1. 如果数值A2 1.00，10倍以上稀释样品，并再次测定，如果数值A2 0.10，样品不要进行过分稀释（将100倍稀释改为10倍稀释）。2. 由于INT对光有敏感性（显色剂在药片中），长时间的反应将导致溶液颜色加深，因此必须按照推荐的操作方法进行测定。3. 在进行试验前，瓶1提前从冰箱中取出，并恢复到室温，如果温度 23C，反应过程将很快结束。4. 添加药片到1.5 mL溶液1和1.52 mL蒸馏水中，确保药片全部溶解后测定的 0 吸光度值作为空白对照，然后加入20u
12、L 的L-苹果酸脱氢酶（瓶3），5分钟后测定增加的吸光度值(A2)，微小的吸光度变化(A2)是没有意义的（如由0.00到0.01）。计算:AL-苹果酸 = 增加的吸光度值 (A2)按照常规AL-苹果酸 的数值至少要在0.10个吸光单位，才能获得满意的试验结果。L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算（参照图3中的标准曲线）:未经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x DAL-苹果酸 g/L20uL经稀释的样品c = 0.771 x 稀释系数 x AL-苹果酸 g/L经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x AL
13、-苹果酸 x 102/100 g/L= 0.786 x DAL-苹果酸 g/L20uL经稀释的样品c = 0.786 x 稀释系数 x DAL-苹果酸 g/L注释:102/100 = 经PVPP处理的葡萄酒的容差图 1. 用分光光度仪测定(25C, 1 cm管径)的MegaQuantTM L-苹果酸随时间的变化。注意: 用此方法测定的L-苹果酸浓度比图3中测定的浓度要低，是由于此方法中使用的测试管管径为1 cm，而MegaQuantTM测试管大约为1.3 cm.测试方法 B (对 “缓慢反应”的处理)1. 取1.5 mL 溶液1( 23C或更高)和1.5 mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0
14、mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。2. 用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。3. 加入20uL葡萄酒样品经PVPP处理的红葡萄酒，充分振荡混合。4. 大约1分钟后，将试管插入到MegaQuantTM测定仪，按下开关直到屏幕上显示-（大约2秒钟）。5. 当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A0），同时记录时间。6. 取下试管5分钟，再次插入试管按下开关直到屏幕上显示1 second，插入试管前不要按压按钮，否则将导致测定仪读取错误 ,记录下数值A1（经过5分钟由于存在缓慢反应将导致颜色增深）。7. 取下试管，立即加入20uL瓶3溶液（L-苹果
15、酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。8. 再次将试管插入MegaQuantTM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示吸光度,记录下数值A2。9. 为了确保试剂完全反应完全，在5分钟内每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值变化不超过0.01个吸光单位。（参考图1和图2）计算:AL-苹果酸 = (A2-A1) - (A1-A0)由于A0数值为0，因此可以简化为：AL-苹果酸 = A2 - (2 x A1)例如（参照图1）: A2 = 0.42；A1 = 0.02AL-苹果酸 = 0.42 - (2 x 0.02) = 0.42 - 0.04 = 0.38按照常规AL-苹果酸
16、 的数值至少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算（参照图3中的标准曲线）:经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x AL-苹果酸 x 102/100 g/L= 0.786 x DAL-苹果酸 g/L20uL经稀释的样品c = 0.786 x 稀释系数 x DAL-苹果酸 g/L注释:102/100 = 经PVPP处理的葡萄酒的容差图 2. 用分光光度仪测定(25C, 1 cm管径, 492nm)的MegaQuantTM L-苹果酸随时间的变化。测试样品为用PVPP处理并过滤的不同浓度的红葡萄酒（0-1
17、8ug），加入样品后测得A0，经过5分钟反应测定吸光度A1，可计算出“缓慢反应”比率，然后加入L-苹果酸脱氢酶（20uL）继续反应10分钟5分钟后测定吸光度值A2，如果使用MegaQuantTM测试仪进行测定，A0的吸光度值为0。制备样品:稀释样品.比色杯中（如：分析20 uL的样品）的L-苹果酸含量必须在1.54-15ug之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.007 -0.75 g/L之间。估计L-苹果酸浓度(g/L)蒸馏水稀释稀释系数F 0.750.75-7.57.5-75不用稀释1 + 91 + 99110100样品处理事例:(a) 测定葡萄汁和白葡萄酒中的L-苹果酸含量测定白葡
18、萄酒和葡萄汁中的L-苹果酸含量，样品通常不需要处理，可直接进行测定。如有必要可以进行稀释。样品处理事例:(b) 测定红葡萄酒中的L-苹果酸含量取5 mL红葡萄酒加入到10 mL的聚丙烯试管中，加入1片PVPP药片（瓶5），拧紧试管盖，充分混合5分钟，用Whatman No. 1 (9 cm)滤纸过滤，收集大约1 mL的滤液，滤液的颜色不能深于浅粉色（一般处理法），然而，如果滤液为深红色，还要在进行处理，但需要加入2片PVPP，充分挤压收集滤液1 mL。澄清的或浅粉色的滤液可以直接进行测定。(c) 测定葡萄中的L-苹果酸含量取200 mL蒸馏水加入到500 mL的量筒中，加入葡萄使体积刚刚超过4
19、00 mL，再加入400 mL以上的等体积蒸馏水（如: 总体积为420 mL，需另外加入蒸馏水20 mL），这样就等同于对葡萄进行了2倍稀释，然后充分均质3分钟，然后用Whatman No. 1（9 cm）滤纸过滤，弃去最初的几mL滤液，收集后来的5-10 mL滤液，稀释后可以直接进行测定。单个葡萄也可以进行测定，压碎葡萄收集葡萄汁到10 mL的量筒中，然后用等体积的蒸馏水稀释，混合均匀后过滤，收集的提取液稀释后可以直接进行测定。图 3. 用MegaQuantTM 测定仪测定的L-苹果酸浓度(ug/每个测定)相对于吸光度的标准曲线（室温; 505 nm）参考文献:1. McCleary, B.
20、V. and Charnock, S. J. (2005). Reagent components in tablet form for colorimetric assays of food and beverage analytes. Patent submitted.2. Mollering, H. (1985). L-Malate. In Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.), 3rd ed., Vol.VII, pp. 39-47, VCH Publishers (UK) Ltd., Cambridge, UK.验
21、证MegaQuantTM 测定仪和L-苹果酸测试的精确性和可靠性:1. 我们可以提供用于MegaQuantTM 测定仪校验标准，仪器参数在使用过程中不应改变。2. 可以通过试剂盒中提供的L-苹果酸质控标准验证MegaQuantTM 测定仪的准确性，将样品替换为L-苹果酸质控标准20uL，按照试验步骤进行测定，可以得到的吸光度(A2-A1)为0.49，如果存在差别，可能是由于移取液体的误差导致的。MegaQuantTM 测定仪使用和维护注意事项错误信息仪器面板上可能出现各种不用错误信息，具体错误原因及处理办法如下：错误信息显示原因处理E1使用的空白管有颜色、不干净或有划痕使用干净的、干燥的空白管
22、重新测定E2或E3a) 不正确的空白对照结果b) 仪器漏电a) 使用正确的空白，重新读0b) 返回维修E4电压太低更换电池E5散射光影响了读取a)从聚光灯或其他强烈光源下移开b)检查仪器损坏原因维护与保养使用干净的测试试管，测试前将试管盖拧紧，以防试剂溅入到仪器中，如果有溢出立即用棉织物擦拭干净，不能用溶解性的或腐蚀性的溶液擦拭仪器。当显示屏上出现“B”，提示需要更换新的电池，轻轻的拉下仪器后部的电池面板，使用2节1.5VAA 碱性电池，如果长时间不使用，需要将仪器内的电池取出。MegaQuantTM 测定仪自售出之日起保修期为1年，意外损坏或由于错误操作和未在指定地点维修导致的损坏不在保修范围之内。如果需要维修请联系我们。技术规格：仪器类型单波长505nm，并预制了测定程序光学元件Palintest M2 光学系统，蓝绿LED显示屏，滤波器和光电探测器测量范围0.00-1.20个吸光单位运行温度0-40C / 32-104F显示屏10 mm LCD测试用试管圆底或平底试管, 1.60 cm OD, 1.415 cm light path开关单个按钮空白/0设置对每一个测试可做记忆或重置选择内部校正出厂时已设定测定基座设有软垫以防止溶液溅落电源2节1.5VAA 碱性电池大小17.3 x 7.5/4.4 x 4.1 cm
