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1、 猪I型与II型干扰素的克隆、表达及抗病毒活性比较陈雪梅, 薛清华, 祝荣格, 付显华, 杨利敏, 孙蕾, 刘文军中国科学院病原微生物及免疫学重点实验室 中国科学院微生物研究所分子病毒中心, 北京 100101摘 要: 干扰素(IFN)是由多种细胞受病毒感染或其他生物诱导剂刺激而产生的天然蛋白质, 主要功能为抗病毒增殖、调节免疫反应和激活免疫细胞等。本研究克隆并测序了猪干扰素(PoIFN)a、g、a g及w基因。构建原核表达载体pET-His/PoIFN-a、pET-His/PoIFN-g、pET-His/PoIFN- ag和pET-His/PoIFN-w, 转化大肠杆菌Rosetta(DE3
2、)进行表达, 经纯化、复性得到具有生物学活性的蛋白。用细胞病变抑制法在Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV系统上进行抗病毒活性测定, 结果表明猪a和ag融合干扰素有较为显著的抗病毒活性, 抗PRRSV活性高达108 U/mg; 猪g干扰素活性效价约为a干扰素的1/2到1/3; 猪w干扰素几乎未检测到抗病毒活性, 需进一步验证。本研究对干扰素在抗病毒、提高机体免疫方面的应用提供了理论依据。关键词: 猪干扰素, 抗病毒活性Comparison of antiviral activities of porcine interf
3、eron type I and type IIXuemei Chen, Qinghua Xue, Rongge Zhu, Xianhua Fu, Limin Yang, Lei Sun, and Wenjun LiuChinese Academy of Sciences Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Center for Molecular Virology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, Chi
4、naAbstract: Interferons (IFNs) are natural proteins produced by wide variety of cells in response to viral infection or other biological inducers, and they execute diversified functions as antiviral defense, immune activation and cell growth regulation. Four genes encoding porcine interferons (PoIFN
5、), PoIFN-, PoIFN-, PoIFN- or PoIFN-, were cloned and sequenced. The four types of porcine interferon genes were subcloned into the pET-His vector, and expressed in Escherichia coli Rosetta (DE3). The recombinant products were purified and renaturalized from inclusion bodies to obtain a native state
6、of well biological activity. Antiviral activity assays for porcine interferons were performed and evaluated by standard procedures in following cell/virus test systems: Marc-145/PRRSV, Marc-145/VSV, PK-15/VSV, Vero/VSV or MDBK/VSV. The data showed that both PoIFN- and PoIFN- demonstrated significant
7、 antiviral activities, and the titer of them against PRRSV was up to 108 U/mg. PoIFN- had approximately half or one-thirds antiviral activity of PoIFN-. PoIFN- showed inconspicuous antiviral activity.Keywords: porcine interferon, antiviral activity干扰素是人或动物细胞受到病毒感染等刺激后由巨噬细胞、淋巴细胞及体细胞产生的一类多功能细胞因子, 是天然免
8、疫反应的重要成分。根据其抗原特性、分子序列结构的差异, 干扰素可分为3大类: I型、II型和型。I型干扰素缺少内含子, 包括IFN-abwstwkx等多个亚型, 主要功能为“抗病毒细胞因子”; II型干扰素即IFN- g, 又称为免疫干扰素; 最近在人、鼠、鸟和鱼中新发现了型干扰素, 包括IFN-l1、IFN-l2和IFN-l3 14。1985年, Hauptmann和Swetly首先从人淋巴瘤cDNA中发现了干扰素w基因5, 该基因被认为是在116132万年前从干扰素a基因进化而来6。目前研究发现w干扰素基因在各种哺乳动物中广泛存在, 如山羊、绵羊、牛、马、兔和猫等2,7, 但在犬基因组中该
9、基因缺失81991年, Mege发现了5个猪w干扰素基因, 其中2个是假基因, 另外3个可编码功能蛋白9。我国是养猪大国, 猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等多种猪病毒性传染病给养猪业带来了巨大的经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗, 仍不能有效控制疾病流行。动物用基因工程干扰素具有无药物残留、无副作用等特点, 属于新型的蛋白质类兽药。干扰素通过激活细胞中多种功能基因的转录, 调节各信号传导通路的协同作用, 能够发挥广谱抗病毒、调节免疫细胞以及免疫调节等多种生物学功能, 对体外抑制多种病毒的增殖, 已初见成效10,11。因此研究开发这种新型的抗感染药物具有积极的现实意义。本实验
10、克隆、表达及纯化了猪干扰素PoIFN-a、PoIFN-g、PoIFN-ag和PoIFN-w, 并用细胞病变抑制法详细比较了4种猪源干扰素在不同细胞系上, 对不同病毒的抗病毒活性。1 材料和方法 1.1 材料1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌DH5a、Rosetta(DE3)为本实验室保存; pMD18-T载体购自TaKaRa公司; pET-His表达载体购自基因动力公司。1.1.2 细胞系、病毒株牛肾细胞(MDBK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、猴肾细胞(Marc-145)、猪肾细胞(PK-15); 水泡性口炎病毒(VSV)、猪繁殖与呼吸综合征病病毒(PRRSV)由本实验室保存。1.1.3 试剂、
11、引物各种工具酶购自TaKaRa公司; Trizol试剂、superscriptTM III first-strand synthesis system for RT-PCR试剂盒购自Invitrogen 公司; Ni-NTA纯化柱购自QIAGEN公司; DMEM细胞培养基购自Gibco公司; 质粒提取和胶回收试剂盒为Promega生物技术公司产品。引物由上海生工公司合成; 测序由上海生工公司完成。1.2 方法1.2.1 提取总RNA、RT-PCR合成cDNA以Trizol试剂法分别从猪外周血细胞、被VSV感染12 h后的PK-15细胞中提取总RNA。以总RNA为模板, 用Invitrogen
12、superscriptTM first-strand synthesis system for RT-PCR试剂盒反转录合成cDNA。1.2.2 PCR扩增目的基因、T载体的构建分别根据GenBank公布的猪a干扰素(Accession No. M28623)、猪g干扰素(Accession No. EU249804)序列, 以猪外周血细胞cDNA为模板, PCR扩增PoIFN-a和PoIFN-g基因成熟区序列; 设计融合引物, 以PoIFN-a与PoIFN-g基因成熟区序列为模板, PCR扩增其融合基因, 即PoIFN-ag, 为保证融合基因所编码蛋白的正确空间构象和正常生物学活性, 在2个
13、基因中间引入了短核苷酸链“ggcgggggtggcagcggtggcgggggatca”, 编码氨基酸“GGGGSGGGGS”; 根据猪w干扰素序列(GenBank上定义为S. scrofa domestica PoIFN-alpha -5 gene, Accession No. X57196), 以病毒感染的PK-15细胞cDNA为模板, PCR扩增PoIFN-w基因成熟区序列。上述引物均引入了BamH I和Hind III酶切位点(表1)。将PoIFN-a、PoIFN-g、PoIFN-ag和PoIFN-w的PCR纯化产物分别亚克隆入pMD18-T载体, 转化DH5感受态细胞, 经BamH
14、I和Hind III双酶切鉴定正确后, 送上海生工公司测序。1.2.3 PoIFN-w序列分析用MegAlign程序对已获得的PoIFN-w基因与GenBank数据库中其他干扰素基因经Clustal W法比对, 并构建核苷酸和蛋白质序列进化树。表1 克隆目的基因PoIFN-a、PoIFN-g、PoIFN-ag和PoIFN-w的引物Table 1 Primers for cloning of target genesGenesPrimersPrimer sequences (5-3)PoIFN-aForwardcgcggatccatgtgtgacctgcctcagacccReversecccaa
15、gcttactccttcttcctgagtctgtctPoIFN-gForwardcgcggatccatgtcttactgccaggcgccctttReversecccaagcttattttgatgctctctggccttPoIFN-wForwardcgcggatccatgtgtgacctgtctcagaaReversecccaagcttaggatgaccccaggtctacPoIFN-agForwardcgcggatccatgtgtgacctgcctcagacccFusion-reverseccgccaccgctgccacccccgccctccttcttcctgagFusion-forwar
16、dtggcagcggtggcgggggatcatcttactgccaggcgcReversecccaagcttattttgatgctctctggcctt1.2.4 原核表达质粒pET-His/PoIFN-a、pET-His/ PoIFN-g、pET-His/PoIFN-ag和pET-His/PoIFN-w的构建及表达将测序正确的重组质粒pMD18/PoIFN-a、pMD18/ PoIFN- g、pMD18/PoIFN- ag和pMD18/PoIFN-w进行BamH I和Hind III双酶切后, 亚克隆入同样双酶切的原核表达载体pET-His, 新的重组质粒分别命名为pET-His/PoIFN
17、- a、pET-His/PoIFN-g、pET-His/ PoIFN-ag和pET-His/PoIFN-。重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3), 37oC培养至OD600值达0.50.6, IPTG诱导4 h。表达产物进行SDS-PAGE检测。1.2.5 重组猪干扰素a、g、ag和w的纯化与复性收集表达菌体, 超声破菌后SDS-PAGE检测, 重组蛋白以包涵体形式表达。包涵体依次用PBS、2 mol/L 尿素和1 mol/L NaCl溶液各洗涤2遍, 6 mol/L盐酸胍中室温变性5 h或4oC过夜至基本溶解, 12 000 r/min离心15 min, 分离出上清, 溶于Buffer
18、 B (8 mol/L 尿素, 0.1 mol/L NaH2PO4, 0.01 mol/L TrisCl, pH 8.0), 加入已用Buffer B平衡的Ni-NTA Agarose, 室温搅拌30 min后上柱。用pH梯度洗脱目的蛋白, 收集洗脱液, SDS-PAGE检测后保存含有目的蛋白的洗脱液。在冷库中(4oC), 按1: 30将目的蛋白洗脱液逐滴加入复性液, 同时不断搅拌以避免产生沉淀, 随后4oC静置48 h。复性液成分为: 0.5 mol/L 精氨酸、2.5 mmol/L EDTA、10%20% 甘油, 0.1 mol/L Tris和1 mmol/L氧化型谷胱甘肽。稀释复性后的P
19、oIFN-、PoIFN-、PoIFN-和PoIFN-在生物安全柜中经0.22 m滤器过滤除菌, 4oC保存。蛋白浓度由Bradford法检测12。1.2.6 重组猪干扰素a、g、ag和w的抗病毒活性检测比较干扰素PoIFN-a、PoIFN-g、PoIFN-ag、PoIFN-w在不同细胞系上抗不同种病毒的活性。所用的细胞系/对应的病毒: Marc-145/PRRSV、Marc-145/VSV、PK-15/VSV、Vero/VSV、MDBK/VSV。测定方法是以细胞病变(CPE)抑制为基础的抑制微量测定法13-15。将状态良好的细胞按2.51053.5105个/mL的密度, 100 mL/孔接种到
20、96孔板中, 37oC、5% CO2条件下培养68 h, 直至细胞单层、贴壁。将预稀释(根据干扰素对细胞毒性实验等预实验调整预稀释倍数)后的干扰素样品按4倍依次稀释6个梯度, 稀释液为含10% FBS的DMEM细胞培养基, 每个梯度可设24个重复。18 h后, 换入用不含血清的DMEM培养基稀释的病毒液(300500 TCID50), 同时设置加病毒不加干扰素的阳性对照组和不加干扰素及病毒的阴性对照组。约30 h(VSV)或72 h(PRRSV)后, 阳性对照组出现90%以上细胞病变时, 进行结晶紫染色, 用酶标仪(Tekan, Grdig, Austria)在570 nm波长读值,根据Ree
21、d-Muench法计算干扰素的抗病毒活性效 价15。抗病毒活性测定实验重复23次。2 结果 2.1 PoIFN-a、PoIFN-g和PoIFN-ag基因鉴定PoIFN-、PoIFN-和PoIFN-的去信号肽基因经1%琼脂糖凝胶电泳检测有特异目的条带, 测序结果表明克隆的基因大小分别为501 bp、441 bp和 969 bp, 符合预期。2.2 PoIFN-基因序列分析从VSV感染的PK-15细胞总RNA中克隆得到去掉N端23个氨基酸信号肽的基因, 测序结果表明该成熟区序列大小为504 bp, 编码168个氨基酸。经GenBank数据库比对, 发现其登录号为X57196, 归为猪干扰素a干扰素
22、家族。然而, 通过与其他哺乳动物干扰素基因序列比对分析, 得出结论认为该基因应属于w干扰素家族, 理由如下: 1)该基因的核苷酸和蛋白质序列与w干扰素家族的同源性比其与a干扰素家族的同源性略高 (表2); 2)该基因编码半胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)的位置更接近于干扰素家族, 如1、29、86、99、133和134位氨基酸; 3)该基因所编码蛋白序列在109113位存在5个氨基酸缺失, 在C端有6个延伸氨基酸, 这与w干扰素家族的特征相符, 而a干扰素家族不存在此特征(图1)2; 4)用MegAlign程序以Clustal W法进行比对, 构建了核苷酸和蛋白质序列进化树, 该基因与w干扰
23、素家族均在一个分支上(图2)。2.3 重组猪干扰素a、g、ag和w的表达、纯化与复性重组质粒转化Rosetta(DE3)大肠杆菌, 37oC IPTG诱导4 h, 目的蛋白能高效表达。经SDS-PAGE检测, 重组蛋白PoIFN-a、PoIFN-g、PoIFN-ag和PoIFN-w的大小分别约为19 kD、17 kD、36 kD和 19 kD。表达产物经包涵体洗涤、过柱纯化后, 蛋白纯度能达90%以上 (图3)。纯化后的包涵体经稀释复性可得到N末端正确加工和二硫键正确形成的具有生物学活性的蛋白质。Bradford法检测终浓度分别约为0.148 mg/mL、0.139 mg/mL、0.106 m
24、g/mL和0.128 mg/mL。表2 猪、人、猫和牛干扰素在核苷酸和氨基酸水平上的全序列(含信号肽)相似性Table 2 Similarities (%) of nucleotides (top line) and amino acids (bottom line) full-length sequences among porcine, human, feline and bovine interferon 1234567891011121*79.275.982.21.21.01.51.068.868.865.371.2PoIFN alpha271.0*77.378.66.13.64.44
25、.272.472.566.172.4HuIFN alpha336.046.3*75.40.80.83.81.968.570.364.970.2FeIFN alpha469.262.156.1*4.42.31.00.870.369.364.970.8BoIFN alpha522.019.415.724.1*75.481.487.31.30.81.71.9PoIFN gamma619.918.812.015.267.0*77.476.07.58.11.77.5HuIFN gamma722.919.319.820.373.363.4*81.83.61.71.92.1FeIFN gamma823.02
26、4.625.121.582.770.272.8*3.83.52.76.7BoIFN gamma922.950.936.031.320.917.818.222.0*81.675.984.3PoIFN omega1060.364.051.443.021.520.918.223.660.5*73.878.5HuIFN omega1151.917.341.640.719.918.819.319.944.253.6*76.3FeIFN omega1217.363.657.563.622.519.430.720.934.970.565.9*BoIFN omega* same sequences.图1 干扰
27、素成熟区氨基酸序列比较Fig. 1 Alignment of mature amino acid sequences of interferons. Conserved positions of cysteine and proline residues present in real lined box, and an extension of six amino acids at the C-terminal presents in dotted lined box.图2 干扰素核苷酸和氨基酸序列进化树Fig. 2 Phylogenetic trees of interferons. (A
28、) Phylogenetic trees based on nucleotide sequences. (B) Phylogenetic trees based on amino acid sequences.图3 SDS-PAGE检测纯化的PoIFN-a、PoIFN- g、PoIFN-ag和PoIFN-w蛋白Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified PoIFN-, PoIFN-, PoIFN- and PoIFN- protein. M: protein marker; 1: purified PoIFN- protein; 2: purified PoIFN
29、- protein; 3: purified PoIFN- protein; 4: purified PoIFN- protein.2.4 重组猪干扰素a、g、ag和w的抗病毒活性比较用细胞病变抑制和结晶紫染色法在Marc-145、PK-15、Vero、MDBK等细胞上测定了干扰素抗VSV或PRRS病毒的活性, 再以Reed-Muench方法计算其效价, 结果表明猪a和ag融合干扰素均有较为显著的抗病毒活性, 猪g干扰素活性约为a干扰素的1/2到1/3(表3, 图4), 而猪干扰素w几乎未检测到活性(数据未给出)。值得注意的是, 在体外实验中, 猪干扰素a、g、ag对PRRSV的抗病毒活性效价
30、高达107108 U/mg, 说明干扰素极有潜力成为治疗猪繁殖与呼吸综合征的新型蛋白质类药物。表3 猪干扰素在不同细胞系上对不同病毒的抗病毒活性比较Table 3 Antiviral activities of porcine interferons against different virus on various cell lineAntiviral activities (105 U/mg)Marc-145/ PRRSVMarc-145/ VSVPK-15/ VSVVero/ VSVMDBK/VSVpIFN-a2464.328.452.45268pIFN-g87.82.284.140.
31、9553.2pIFN-ag1592.387.802.091743 讨论 本实验克隆表达了猪I型及型干扰素的4个基因, PoIFN-a、PoIFN-g、PoIFN-ag和PoIFN- w, 并研究了其抗病毒生物学活性。其中PoIFN-a、PoIFN-g基因序列已发布在GenBank数据库16, 曹瑞兵17、Xia18、Cencic19等在原核或真核中也成功表达了这2种猪干扰素, 并检测了其生物学活性。PoIFN-ag是型和型干扰素的融合基因。PoIFN-w基因虽早在1991年已被发现9, 但却被误归到a干扰素家族, 通过比对基因和蛋白序列、比较保守氨基酸Cys和图4 猪干扰素在不同细胞系上对不同
32、病毒的抗病毒活性比较Fig. 4 Antiviral activities of porcine interferons against different virus on various cell line.Pro的位置、构建进化树等手段, 作出结论认为该基因属于a干扰素家族。在体外实验中, 用细胞病变抑制法比较了原核表达的4种猪干扰素的抗病毒活性。结果表明, PoIFN-a、PoIFN-g和PoIFN-ag均能抑制VSV或PRRSV感染Marc-145、PK-15、Vero或MDBK细胞, 猪干扰素在同源和不同源细胞系中都表现了较好的抗病毒生物活性, 初步显示了其抗病毒的高效性和广谱性。
33、由于测活系统的细胞系和病毒种类不同, 干扰素和细胞中干扰素受体的相互作用有差异, 统计学方法计算得到的效价变化范围较大: 在Marc-145/PRRSV或MDBK/VSV系统中, 干扰素的活性效价较高, 达到了107108 U/mg, 而其他系统中, 效价大约为105 U/mg。然而, 猪干扰素在各个系统中均未表现出抗病毒活性, 可能存在的原因有: 该蛋白本身活性很低, 在体外实验中无法检测; 表达和复性工艺未能使干扰素恢复成具有生物活性的蛋白质。对此需要进行进一步的研究。此外, 尽管PoIFN-ag融合干扰素在体外实验中并未表现出更为显著的、叠加的生物学活性, 但该蛋白结合了I型干扰素在抗病
34、毒方面及型干扰素在免疫调节方面的优势, 这些特性很可能使该干扰素在猪病毒性疾病的临床治疗上发挥更优越的效果。基因工程干扰素能够快速发挥抗病毒作用, 提高动物机体免疫功能, 增强抗病防病能力, 不仅对猪流感、猪水疱病、猪轮状病毒感染、猪传染性胃肠炎、猪繁殖与呼吸综合征等病毒感染都具有一定的预防效果, 且能与灭活疫苗、抗体类药物联用, 弥补免疫空白期, 增强免疫效果, 无药物残留, 是值得研究和推广的新型蛋白质药物。REFERENCES1 Lefevre F, Boulay V. A novel and atypical type one interferon gene expressed by
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45、dcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdcdc科学出版社科学出版中心生命科学分社新书推介可再生能源的微生物转化技术 宋安东等 编著978-7-03-024586-1￥55.002009年5月 出版本书在分析当前全球面临的能源和环境危机的基础上, 阐述了利用生物质转化为主的生物炼制的内涵, 将微生物技术与可再生能源转化有机结合起来, 全面论述了利用微生物技术转化可再生能源的基础理论、基本工艺、基本装备、应用情况和发展前景。内容主要包括生物炼制、生物沼气、生物氢气、生物乙醇、生物丁醇、生物柴油、生物采油、生物燃料电池、煤炭的生物转化、能源的洁净化等方面，为读者展示了能
46、源微生物技术的全貌。本书是一部全面反映可再生能源生物转化的新技术、新材料、新方法、新进展的集理论性和实践性为一体的专著。本书可以作为生物、环境、能源、生物化工等领域有关科研人员、生产技术人员的参考书, 也可作为高等院校的生物技术、生物科学、生物工程、生物化工、能源工程、资源利用等专业的研究生、本科生的教学用书。现代生物能源技术 美国国家可再生能源实验室生物能源技术报告 美国国家可再生能源实验室 编著鲍杰 译 叶勤 金浩 校978-7-03- 024519- 9 ￥48.002009年5月 出版本书第一篇是玉米秸秆生产燃料乙醇的过程设计与技术经济评价技术报告, 由美国国家可再生能源实验室(NREL)于2002年完成。该报告中的过程设计和技术经济评价模型对新的技术进展带来的成本削减预测非常有用, 可以对新的技术进展转换为过程设计上的改进和经济效益上的提高进行快速评价。第二篇是基于生物质来源的高附加值生物基化学品与材
