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1、Princple and Technology of Genetic Engineering基因工程原理,1,Introduction about the lesson绪论：,总学时：72学时（total class hours）讲授基因工程原理：24学时基因工程技术实验课：32学时基因工程技术实习：16学时,2,1）T.A.Brown著，魏群等译基因克隆和DNA分析（中文版）2）T.A.BrownGene Cloning and DNA Analysis（英文版）3）Desmond S.T.NichollAn Introduction to Genetic Engineering（英文版）4
2、）楼士林基因工程5）吴乃虎基因工程原理,推荐参考书：,3,Introduction,教学目的与要求：1）掌握基因工程概念、基因工程操作主要步骤。2）了解基因工程发展的历史。3）了解基因工程课程的主要内容，学习基因工程的基本方法。,4,5,一、基因工程课 程的主要内容和学习方法,内容：,6,学习基因工程的基本方法：,建议听课记笔记，强调掌握实验技术,二、基因工程定义（The conception of Gene Engineering）,基因（gene）是遗传的物质基础，是DNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列，即具有遗传效应的DNA分子片段。,Genes are located on chr
3、omosomes.Locus is the site at which a gene is located on a chromosome.Alleles is one of two different forms of a particular gene in diploid organisms.,Gene is the basic unit of genetic information(the unit of inheritance),a region of DNA that encodes one function.,7,基因是生命的密码，基因中储存着生物个体生长、发育及衰亡过程的全部信
4、息，通过复制、表达、修复，完成生命繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理生化过程。因此，基因与人和所有生物的生、老、病、死等一切生命现象有关，同时也与人和所有生物的健康密切相关。,gene engineering also known as genetic engineering,gene manipulation,gene cloning(molecular cloning)recombinant DNA technology,genetic modification,and the new genetics,means altering the genes in a living organ
5、ism to produce a Genetically Modified Organism(GMO)with a new genotype.,8,基因工程(Gene engineering)是指将一种生物（供体）的基因转移到另一种生物（受体）中去，创建具有某种新性状的生物新品系并能稳定遗传给后代的一种现代生物技术。,三、基因工程基本操作步骤及基因工程应用The basic steps and application in genetic engineering,1)Isolate the gene(DNA fragments)2)Joining to a vector or carrier
6、molecule3)Insert it in a host cell,produce as many copies of the host as possible,or generate a transgenic plant or a transgenic animal(GMO)4)Separate and purify the product of the gene,9,The four steps in a gene cloning,10,四、基因工程发展的重要阶段和关键技术 The foundations and key technology of the emergence of ge
7、netic engineering,The foundations of the emergence of the genetic engineering,Gregor Mendel 1864,11,20世纪20年代，美国T.H.Morgan等人创立遗传的染色体理论，指出基因在染色体上。,Nobel medal Half a pound of 23-karal gold.2.5 inches across,12,1944年 Oswald Avery(Canada)证明基因的化学本质是DNA分子（He was not awarded Nobel Prize）,Di-plococcum pneum
8、onice DNA as genetic material,1948.retired,The Nobel committee has been criticized for not recognizing Averys achievement before his death(1877-1955),Xray photograph of DNA with high quality,Rosalind Frankin,13,1953年J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。1958年F.Crick提出遗传信息的中心法则。,Francis Crick(35y),19
9、51 James Watson(23y),丹麦哥本哈根,剑桥大学 Cavendish Lab.,14,Xray photograph of DNA with high quality,Nuraspora crassa,15,1961年M.W.Nirenberg破译出第一批遗传密码。1966年再与S.Ochoa和 H.G.Khorana破译全部遗传密码。,The Nobel Prize in 1968,16,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 for the discovery of restriction enzymes and the
10、ir application to problems of molecular genetics,1965,Werner Arber,restriction enzyme限制性核酸内切酶,17,1970，Reverse transcription逆转录酶的发现,1967，DNA ligase 发现连接酶,18,1972年，美国H.Boyer,P.Berg 等发明了重组DNA技术(recombinant DNA technology)(marked the emergence of gene cloning),19,The Nobel Prize in Chemistry 19801972年，大
11、肠杆菌含两种抗药性基因的质粒“拼接”成“杂合质粒”，转入大肠杆菌，具双重抗药性。标志着基因工程的首次成功。1973年，将金黄色葡萄球菌的质粒（含抗青霉素的基因）引入E.coli获对青霉素的抗药性，外源基因表达。两栖动物非洲爪蟾DNA引入获表达，证明基因工程不受生物种类研制，可以人为拼接基因，创造新物种。,20,21,五、基因工程课程与其他学科的关系,遗传学、细胞生物学、生物化学和分子生物学是基因工程学的基础，尤其是分子生物学奠定了基因工程学的理论基础，生物化学等为基因工程学提供了基础的技术手段及其技术原理，是分子生物学发展为一门以应用为指导的学科。该学科为充实和补充现代遗传学、生理学好分子生物
12、学提供了技术手段，为现代生物技术制药奠定了基础。,22,本章思考题：,1）什么是基因工程？2）基因工程的操作步骤有哪些？3）基因工程的应用范围？基因操作可以应用在哪些领域？4）什么是GMO？5）在基因工程领域有重要贡献的科学家有哪些？试例举三位及其贡献。6）基因工程的三个发展阶段？,23,第一章 基因表达元件及调控,教学目的与要求：1）掌握基因概念的扩展，基因的基本类型、表达元件及结构、调控元件及作用。2）掌握基因表达的中心法则。3）掌握基因表达调控的基本原理。,24,DNA变性（DNA denaturation）,D.S.DNA,S.S.DNA,(heat,uttermost pH,urea
13、,acyl),Denaturation temperature：90-95Renaturation temperature：37-60,第一节 基因的化学属性及特征,1944年 O.Avery 证明基因的化学本质是DNA分子,25,在DNA双链变性产生单链时，由于碱基的发色基团暴露，光吸收值会增加，这种现象称DNA增色效应的跳跃现象。,D.S DNA A260=1S.S DNA A260=1.37dNTPs A260=1.60,DNA分子变性过程的表现 1）S.S.DNA粘度降低 2）DNA增色效应的跳跃现象(Jump of Hyperchromicity),26,DNA变性及Tm 值,1）D
14、NA分子中A、T、C、G 随机分布的情况下，,2）GC%含量相同的情况下，AT形成变性核心，富含AT区域，变性加快，Tm 值小。,3）增色效应的跳跃现象，高分子量DNA分子在热变性过程中,富含AT区域首先变性,然后逐步扩展,增色效应表现跳跃现象,使变性过程加快。,生化上以Tm值量化DNA分子变性的程度。高温使DNA双链分开而变性，随着温度的升高，DNA分子变性区域增加，Tm是指DNA分子变性一半时的温度。,27,DNA分子的复性（anneal or renaturation）,变性,复性,复性依赖于单链分子间随机碰撞(Depends on the collision of complement
15、ary S.S.DNA),高温打开的DNA单链，在温度逐渐降低时，又会重新配对形成双链。这个过程称为DNA分子的复性。,28,The transcriptional unit is the DNA region from transcription start point(TC)to transcription stop site(tC),which produces the RNA.Within transcription unit lies the coding sequence,from the translation start site(TL)to translation stop
16、site(tL).The upstream regulatory region may have controlling elements such as enhancers or operators in addition to the promoter(P),where is the RNA polymerase-binding site.,一、表达基因的基本结构元件,第二节 表达基因结构及基因表达与调节（Gene organization）,29,The processes of transcription(TC),translation(TL)and DNA replication(R
17、)obey this rule.An exception is found in some RNA viruses,which carry out a process known as reverse transcription(RTC),producing a DNA copy of their viral RNA genome.,二、基因表达的中心法则（The Central Dogma）,This states that information flow is unidirectional,from DNA to mRNA to protein.,30,Gene expression：,
18、mRNA,coding/noncoding,sense/antisense,plus/minus,transcribed/non-transcribed,template/non-template,IUB and IUPAC favor the terms coding/non-coding,with the coding strand of DNA taken to be the mRNA-like strand,31,The genetic code,32,三、乳糖操纵子学说（The Lactose operon）Monod and Jacob 1961,The structural ge
19、nes(the genes that code for proteins)lacZ,lacY and lacA encode-galactosidase,galactoside permease and a transacetylase,respectively.The cluster is controlled by a promoter(P)and an operator region(O).The operator is the binding site for the repressor protein,encoded by the laci gene(i).The repressor
20、 gene lies outside the operon itself and is controlled by its own promoter,Pi.,In prokaryotes cells such bacteria,genes are usually found grouped together in operons.,The polycistronic mRNA,33,34,1、错读终止密码子（Mis-reading for stop codon）1973年，A.Weiner，Q RNA virus产生两种蛋白，是由于第一个终止密码子错读引起的。,一、基因重叠方式,第三节 重叠基
21、因,35,2、阅读框不同（Alternate different reading frame）,36,Sanger1977年在X174病毒中，发现从不同起始密码子到不同终止密码子的两个不同的编码序列，产生了完全不同的基因产物，其中部分碱基序列是重复使用的。,3、选择不同的起始密码子和终止子（Selection different start codon or stop codon）,37,人们发现在SV40病毒中，选择了不同的起始密码子和终止子，从而导致了在一段DNA序列中有多个基因信息。,4、基因突变（gene mutation）,38,如果仅是某个碱基发生突变，突变后的密码子编码的氨基酸不
22、变（密码子简并性），则是同义突变，基因产物相同。,利用遗传密码子的简并性，可以在人工合成基因时为消除酶切位点或表达基因寄主的密码子偏好性确定不同的密码子。,39,如果某碱基突变导致该密码子编码氨基酸变化，产生的错义突变，则基因产物（蛋白酶）可能就失去原基因产物的功能。,错义突变会造成翻译过程中其下游的三联密码子都被错读，产生完全错误的肽链或肽链合成提前终止。,40,错义突变的例子镰状细胞贫血症:编码血红蛋白b肽链上一个决定谷氨酸的密码子GAA变成了GUA，使得b肽链上的谷氨酸变成了缬氨酸，引起了血红蛋白的结构和功能发生了根本的改变。,41,基因插入突变或缺失突变会造成翻译过程中其下游的三联体密
23、码子发生变化，产生完全不同的肽链或肽链合成提前终止，这是一类移码突变。,二、重叠基因种类,I 类：反向重叠基因（重叠基因分布在同一DNA区域的不同单链上）II 类：同向重叠基因（重叠基因分布在同一DNA区域的同一单链上）,42,三、重叠基因的生物学意义,1）原核生物进化的经济原则(较小基因总量编码较多的基因信息)2）提高蛋白质的疏水性,以增强生物体自然选择的适应性,3）基因表达调控理论发展 4)丰富和发展了基因的概念,43,一、间隔基因发现,第四节 间隔基因(Splitting gene),间隔基因发现示意图,44,1977年，France,Pierre Chambon最先发现在血清蛋白和血红
24、蛋白cDNA基因中EcoR I和HindIII酶切位点消失，而其DNA序列中有这两种酶的酶切位点。说明两种基因的DNA和cDNA序列有差别。,间隔基因与cDNA配对杂交产生Loop,45,以cDNA与DNA杂交，DNA链会发生因不能配对而形成的环状结构,二、间隔基因概念,1978，Gilbert提出真核生物基因的新概念:真核生物的结构基因是由若干 外显子（exon）和内含子（intron）相间隔排列的序列组成的间隔基因。因此，真核生物基因又称为间隔基因或断裂基因（Splitting gene or Interrupted gene）。,。,46,真核生物基因的转录物又称为前体mRNA或核内不均
25、一 RNA Precursor mRNA(pre-mRNA）Heterogeneous nuclear RNA(HnRNA),。,断裂基因转录出mRNA,47,外显子 是DNA 与成熟RNA间的对应区域，是氨基酸的编码区（amino acid coding region）非间，故又称非隔区（unspacer)。Exon is any segment of an interrupted gene that is represented in the mature RNA product 内含子是 DNA 与成熟RNA间的非对应区域，是不编码氨基酸的区域（uncoding region），又称间隔
26、区（spacer)。Intron is a segment of DNA that is transcribed,but removed from within the transcript by splicing together the sequences(exons)on either side of it.,48,二、Splitting Gene 的普遍性,大多数真核生物的结构基因都是断裂基因。in Eukaryots，most of structural gene：tDNA,rDNA，mtDNA,cpDNA,Loop and Intron loop are marker of ide
27、ntifying the splitting gene可通过mRNA与DNA杂交产生的径环结构确定断裂基因a）R-looping in which mouse globin per-mRNA was hybridized to a cloned mouse-globin gene.A smooth hybrid formed(introns are represented in mRNA)b）R-looping in which mature mouse globin mRNA was used to hybridized to a mouse-globin gene.A large intr
28、on in the gene looped out(the intron no longer present in the mRNA),49,三、断裂基因的相对性,50,一般情况下，intron在转录后的mRNA拼接中要被清除。但也发现：,a)内含子并非“含而不露”如酵母细胞色素b基因中的第II个intron 参与成熟mRNA的编码。b)外显子并非“表里如一”人类尿激酶原基因Exon I不编码氨基酸序列c）并非真核生物所有的结构基因均为断裂基因 组蛋白（histone）基因、干扰素(interferon)基因、酵母中多数基因不是断裂基因,四、真核生物基因表达的空间间隔,51,真核生物基因转录与
29、翻译的空间间隔,真核生物基因转录在细胞核中，翻译在细胞质中。,一、基因转座现象的最初发现,第五节 跳跃基因（Jumping gene/Transposable element）,基因转座显现最早记录的是1914年康奈尔大学 A.Emerson研究玉米果皮花斑突变提出来的,1936年，印地安那州立大学Marcus.M.Rhoabes又在玉米糊粉层细胞发现斑点突变,1947，CSH 的科学家Barbara McClintock又提出，玉米糊粉层花斑不稳定现象伴随着系列染色体遗传的遗传事件。,52,二、转座的遗传现象,1）诱变效应：提高重组频率、形成易变基因2）切除效应：倒位、缺失、重复、foot
30、printting3）双转座效应：外显子改组（exon shuffling）4）位置效应：启动表达、增强表达5）转座爆炸：激活表达、基因内重排突变基因形成,53,一、假基因的概念,第六节 假基因（pseudo gene）,与正常基因结构相似，但丧失正常功能的DNA序列，往往存在于真核生物的多基因家族中。,二、假基因的种类,1功能基因累积突变型 非洲爪蟾 5s rDNA family 人-globin-1 3 个缺失区段 多个移码突变 intron 及拖尾序列改变,54,2.加工基因（processed gene,retrogene逆基因）归类于非病毒类 retro-transposon（逆向转
31、座子）1980.Leder 发现 rat-globin,-3 基因中无 intron 1982.Temin 证实chicken-tubulin family 中存在 processed gene。,Ribozyme拟酶,Abzyme抗体酶,rDNA,tDNA,55,第七节 信号肽 signal peptide,信号 肽是指合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端氨基酸序列。一般由15-30个氨基酸序列组成。如在基因工程中生产药物蛋白，就要保证其表达量高和不被降解。信号肽的作用非常重要。,例如：A modified amino acid sequence of hEGF-SEKDEL
32、MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGPGPSEKDEL*,56,一、基因组定义,第八节 基因组与基因组计划,前述，基因是具有遗传效应的DNA分子片段。基因组（Genome）则是一个物种中所有基因的整体组成，即生物体的全部DNA分子。如人的基因组包括23对染色体的全部基因序列。,57,60年代初，美国总统Kennedy提出两个科学计划：登月计划攻克肿瘤计划 人类遗传信息的复杂性,HGP(Human Genome Project)Target：to make known the Mystery of hereditary i
33、nformation of human,二、人类基因组计划,1、历史回顾,58,曼哈顿原子弹计划,阿波罗登月计划,人类基因组计划,这一计划与“曼哈顿原子弹研制计划”、“阿波罗登月计划”并称为人类科学史上的“三大计划”。中国、德国、法国、日本、英国与美国6个国家的16个中心组成国际协作组，人类基因组计划所倡导的是“全球合作、免费共享”的原则。,59,HGP的历史回顾,1984.12 犹他州阿尔塔组织会议，初步研讨测定人类整个基因组DNA序列的意义1985 Dulbecco在Science撰文“肿瘤研究的转折点:人类基因组的测序”；美国能源部(DOE)提出“人类基因组计划”草案1987 美国能源部
34、和国家卫生研究院（NIH）联合为“人类基因组计划”下拨启动经费约 550万美元1989 美国成立“国家人类基因组研究中心”，Watson担任第一任主任1990.10 经美国国会批准，人类基因组计划正式启动 第一个自由生物体流感嗜血菌(H.inf)的全基因组测序完成1996 完成人类基因组计划的遗传作图启动模式生物基因组计划,James Watson,60,H.inf全基因组,1997 大肠杆菌(E.coli)全基因组测序完成1998 完成人类基因组计划的物理作图，开始人类基因组的大规模测序 Celera公司加入，与公共领域竞争 启动水稻基因组计划1999.7 第5届国际公共领域人类基因组测序会
35、议，加快测序速度,大肠杆菌及其全基因组,水稻基因组计划,61,2000 Celera公司宣布完成果蝇基因组测序 国际公共领域宣布完成第一个植物基因组拟南芥全基 因组的测序工作2000.6.26 公共领域和Celera公司同时宣布完成人类基因组工作草图2001.2.15 Nature刊文发表国际公共领域结果2001.2.16 Science刊文发表Celera公司及其合作者结果,Drosophila melanogaster果蝇,Arabidopsis thaliana拟南芥,62,HGP的最初目标通过国际合作，用15年时间(19902005)至少投入30亿美元，构建详细的人类基因组遗传图和物理
36、图，确定人类DNA的全部核苷酸序列，定位约10万基因，并对其它生物进行类似研究。4张图：HGP的终极目标阐明人类基因组全部DNA序列；识别基因；建立储存这些信息的数据库；开发数据分析工具；研究HGP实施所带来的伦理、法律和社会问题。,遗传图,物理图,序列图,转录图,2、人类基因组计划目标,63,遗传图谱,物理图谱,转录图谱,序列图谱,64,以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造条件。遗传多态性：在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率高于1%。遗传学距离：在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率
37、，1%的重组率称为1cM,genetic map 遗传图谱,65,physical map 物理图谱,构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。,66,1998 年完成了具有52,000个序列标签位点(STS)，并覆盖人类基因组大部分区域的连续克隆系的物理图谱。,敲碎基因组，分析研究内容所处的染色体位置,细菌人工染色体,80,300 kb,）,酵母人工染色体,（数百,2000,kb,中心粒,一对紧密,一对相邻,染色体图,（,）,back,67,transcr
38、ipt map 转录图谱,识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。,Sequence map 序列图谱,68,随着遗传图谱和物理图谱的完成，测序就成为重中之重的工作。DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱,3、HGP对人类的重要意义,（1）HGP对医学的影响发现新的致病基因发展一些复杂疾病的早期基因诊断方法，如“肿瘤基因组解剖计划”通过基因治疗解决传统方法无法解决的疑难杂症疾病易感基因的识别及对风险人群进行生活方式、环境因子的干预人类基因组多样性与个体化医学,69,（
39、2）HGP对生物技术的影响基因工程药物：分泌蛋白（多肽激素，生长因子，趋化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受体；诊断和研究试剂产业：基因和抗体试剂盒、诊断和研究用生物芯片、疾病和筛药模型；对细胞、胚胎、组织工程的推动：胚胎和成年期干细胞、克隆技术、器官再造。,70,（3）HGP对生物进化研究的影响 生物的进化史，都刻写在各基因组的“天书”上。草履虫是人的亲戚13亿年；人是由300400万年前的一种猴子进化来的；人类第一次“走出非洲”200万年的古猿；人类的“夏娃”来自于非洲，距今20万年第二次“走出非洲”？,4、HGP进展与未来 整个完成的时间提前到了2003年，比原计划提前了两年。而原订于20
40、01年完成的人类基因组的基本构图也提前一年，在2000年6月26日由美国总统克林顿与英国首相布莱尔联合宣布完成，这一天也因此成为人类历史上“值得载入史册的一天”。后基因组计划，即功能基因组计划的开始。,71,5、我国对人类基因组计划的贡献 1994年，我国HGP在吴旻、强伯勤、陈竺、杨焕明的倡导下启动，最初由国家自然科学基金会和863高科技计划的支持下，先后启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”和“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构和功能研究”；1998年在国家科技部的领导和牵线下，1998年在上海成立了南方基因中心；1999年在北京成立了北方人类基因组中心；1999年7月在国际人类
41、基因组注册，得到完成人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序任务，该区域约占人类整个基因组的1。,72,transcritable,translatable gene(Z,Y,A),Transcritable but non-translatable gene(tDNA,rDNA),Non-transcritable,non-translatable gene(promoter,operator),基因的类型,73,one gene one enzyme one gene one peptide one gene one function(Ribozyme,Abzyme,rDNA,tDNA
42、.),思考题：,1.What is the difference of DNA and RNA?2.What is the structure of Nucleic Acid?3.What is the content of the Central Dogma of molecular biology？4.What is the difference of Gene structure between prokaryotes and eukaryotes？5.What is the content of the Lactose operon？5.What is HGP？,74,6）某研究小组对一个克隆的DNA序列（非模板）进行测序，其碱基顺序（假定）如下：5-CCGGCGGCAATGGCGGCGTCGGCGACCCAGGAGGCCGACTAACGGACCG-3（1）请写出模板链的碱基顺序及转录的碱基序列（2）翻译从何处开始、何处结束（3）可能编码的氨基酸序列（4）如果基因突变，那部分区段变异会影响该基因编码和蛋白质功能(附密码表),75,The End,Thank You!,
