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1、原 文：Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid作 者：VOLKER BRUSS作者单位：Department of Medical Microbiology, University of Gottingen, D-37075 Gottingen, Germany发表刊物：Virus Research 106 (2004) 199209 以下为中文翻译稿 ： 乙型肝炎病毒核壳的包膜化过程摘要：乙型肝炎病毒（HBV）是一种二十面体的有包膜的DNA病毒，其复制具逆转录过程。HBV衣壳的晶体结构也已经阐明，其组分为有一种蛋白（C蛋白）构成，衣
2、壳直径为36nm。病毒的包膜含有三种多次跨膜的蛋白 （S，M和L蛋白），并且这些蛋白有着共同的C端。这些包膜蛋白不仅作为病毒包膜的组分从感染的细胞中释放，大多数还组装成一种直径22nm的不含衣壳的亚病毒脂蛋白颗粒从细胞中释放，它的量超过所需的一万倍。病毒衣壳的组装发生在胞质中，3.5kb的RNA分子及一些病毒和细胞因子也被一起包装进去。这种新形成的衣壳不能被有效包膜进去。在衣壳腔体内的病毒DNA基因组的逆转录合成的发生需要形成一种出芽复合物的状态。包膜化过程发生在高尔基前体复合物的结构中。这个过程需要S和L蛋白，而不需要M蛋白。L蛋白形成两个不同的跨膜结构。在细胞质一侧的膜上，此蛋白N一端一部
3、分的异构是形成出芽结构必需条件。在这个区域，一个长22个氨基酸的区段的遗传学图谱已经完成，被证实是在形态发生过程有着重要作用。这个区域大概介导了与衣壳的联系。第二个结构域是在S蛋白的细胞质侧的环状区域。一个相似的基因特征在两小的衣壳白表面区域被发现，它大概还介导了在包装过程中与包膜蛋白的相互作用。 前言：乙肝病毒是嗜肝DNA病毒科的代表种，这个科由一小类有包膜的DNA病毒组成，它们为二十面体结构，在特异性宿主的肝细胞中经过逆转录过程复制(Ganem and Schneider, 2001)。这个科的一些成员可以感染哺乳类，例如土拔鼠肝炎病毒（WHV），或者鸟类，例如鸭乙肝病毒（DHBV），此病
4、毒作为了重要的乙肝感染研究模型。病毒DNA基因组相对较小（大约3kb），它仅有4个（为哺乳类病毒），或3个（为鸟类病毒）开放阅读框（见图1）。因此，嗜肝DNA病毒颗粒仅由少数不同的病毒蛋白组成，一种蛋白形成衣壳外层蛋白，一种形成逆转录酶，另外两种或三种蛋白则构成包膜组分。这些少量的结构蛋白使肝炎病毒成为了一种在研究二十面体病毒包装过程中相当适合的模型(Nassal, 1996)。图1.乙型肝炎病毒基因组。长3221bp的环形HBV基因组，带有4个开放阅读框（黑粗线表示），分别为C、E、P和X。它们编码衣壳蛋白、结构蛋白、逆转录酶和一种调节蛋白。白色箭头表示起始密码。启动子（C、PS1、PS2和
5、X）用黑色箭头表示，单一的Poly（A）加尾信号用长方盒表示。开放阅读框E产生三个同尾蛋白（S、M和L），用细线表示。包膜蛋白区域前体S1、S2和S也在图中标示。乙肝导致了人类肝脏的感染和发炎(Hollinger and Liang, 2001)。在世界范围内，超过3亿的人是乙肝携带者。病毒的传播依靠亲本的途径，例如母亲生产婴儿，通过静脉的吸毒方式以及性交过程。不仅仅因为它们在医疗中的重要作用，而且因为它们独特的生物学和小的基因级结构，嗜肝DNA病毒在过去被广泛研究。在研究过程中遇到的主要障碍是缺少感染乙肝的小的实验动物模型，一直到现在，也还是缺少一种有感染性的细胞系(Gripon et al
6、.,2002)。庆幸的是，来自于肝癌细胞的细胞系，例如HepG2和Huh7，当它们转染进病毒基因组后可以产生感染性的病毒颗粒(Acs et al.,1987; Yaginuma et al., 1987)。因此，嗜肝DNA病毒可以在体外进行形态学研究，然而，乙肝病毒的产量还是相对较低。大概估计，每天每个肝细胞在体外感染期间释放出1到10个病毒粒子(Nowak et al., 1996)。在体外这些数量并不会明显提高。因此，通过电镜观察乙肝的出芽是非常困难的(Roingeard and Sureau,1998)。 下面是关于乙肝复制的一个简略的回顾(Ganem and Schneider, 20
7、01)，嗜肝病毒的感染早期并不是十分清楚，直到现在，仅DHBV的一个分子受体被发现和阐述，其它的都还是不十分地确定(Urban et al.,2000)。这个蛋白，然而在其它的一些细胞中并没有表现出一种持续的侵染状态。在进入到细胞质后，核衣壳被转运到细胞核中并释放出部分双链DNA基因组到核中(Rabe et al., 2003)。病毒的DNA被宿主因子修复成完整的双链DNA复合物。四个部分重叠的开放阅读框为哺乳动物嗜肝病毒基因组编码的蛋白，依次为衣壳蛋白C，包膜蛋白，表现出多种功能的有逆转录酶活性的蛋白P和一种调节蛋白X（见图1），在鸟类肝炎病毒中，基因X是缺失的。双链DNA复合物通过宿主因子
8、，利用哺乳动物病毒中的4个起动子和一个Ploy A尾加尾位点完成转录。乙肝蛋白C和P的翻译起始于启动子C处，位于独一天二的病毒基因组加尾信号上游约100bp处。这个信号在第一个扫描机制中被忽略，在第二次的时候产生一个没有切割完成的未端冗余RNA分子（超基因组RNA分子）。基因C转录的位置靠5端非常近，并被翻译成蛋白C。另外，这个转录的mRNA翻译的产物为蛋白P，它来自于下游的第二个开放阅读框。转录起始于启动子C，在mRNA C的上游一点点处，它形成前体C。蛋白C的翻译延伸，并在N端产生一个分泌的信号肽。这个信号使前体的蛋白C进入内质网腔中，在N端和C端进行蛋白的可溶性加工，并最后分泌出可溶的蛋
9、白，形成乙肝的抗原e结构。蛋白C的前体不参于病毒的复制，也不参于病毒的形成和感染(Chang et al., 1987; Schlicht et al.,1987)。它可能作为感染的宿主中的免疫调节因子(Milich et al., 1998)。亚基因组的转录并翻译成3个包膜蛋白（见下）和蛋白X。蛋白P接合于前体的超基因组核心的RNA，位于包装信号处，这个复合物产生的核衣壳蛋白包裹，在衣壳中，通过反转录形成病毒的DNA基因组(Summers andMason, 1982)。第一步，（+）链RNA被反转录成单链的（）DNA，之后随即被降解。第二步，（）DNA作为模板合成（+）DNA。在这个过程中
10、，基因组被球化。（+）链在衣壳中并没有完成，因此，基因组包含着一个单链的缺口。核衣壳此时可以返回到细胞核中并释放基基因组到核质中，完成基因组的扩增(Tuttleman et al., 1986)，或者衣壳在细胞内的后内质网和前高尔基体中形成包膜，作为成熟的病毒颗粒分泌到细胞外。包膜化过程直接依赖于包膜蛋白和衣壳蛋白的相互作用。在以下的部分中，将讨论亚状态乙肝的出芽过程。乙肝衣壳和跨膜的包膜蛋白及病毒的亚结构的相互作用，本文的大多数介绍来自于人类乙肝的研究，还有一些来自于动物的嗜肝DNA病毒。2、乙肝衣壳蛋白乙肝的二十面体衣壳蛋白由多拷贝的蛋白C组成，不同基因型的拷贝数为183或185个氨基酸。
11、在不同的细胞系中，此蛋白都能有效地表达，例如在细菌、酵母、蛙卵细胞和哺乳动物细胞，并且在这些细胞系中，在没有其它乙肝复合物的存在下可以自我组装成为衣壳结构。组装开始于同源二聚体的形成(Zhou and Standring, 1992)，在第61位的半胱氨酸处形成二硫键(Nassalet al., 1992; Zheng et al., 1992)。蛋白C的复合物包含有分子伴侣，已经被发现但还没有详细的细节报告(Lingappa et al., 1994)。最终的病毒衣壳来自于相当弱的内部二聚体相互作用(Ceres and Zlotnick, 2002)。颗粒表现出二种的类型(Crowther
12、et al., 1994)：一种为直径30nm由90个二聚体组成，为T=3的对称结构，另一各种为较大一点的直径为34nm，由120个二聚体组成的为T=4的对称结构。这两种结构在感染的人类肝细胞中也被发现(Kenney et al., 1995)。但是，哪种衣壳存在于感染的病毒中还不是很清楚。蛋白C的C末端氨基酸大约一半为精氨酸。这个区域和精蛋白的相似，涉及到前体基因组和逆转录复合物的包装。在有蛋白P和前体基因组存在时异源性表达核心蛋白，非特异性的宿主的RNA被包装到衣壳内。如果精氨酸富积区域被缺失，核酸的包装则不会发生，但是核心衣壳颗粒仍会有效地形成(Gallina et al., 1989)
13、。在大肠杆菌中，缺失C末端的缺失体会产生大量的较大的颗粒(Zlotnick et al., 1996)。这种材料适合让拆叠的蛋白C在低分辨率的电镜下进行观察(Bottcher et al., 1997; Conwayet al., 1997)，并最终进行了分辨率为3.3的观察(Wynne et al., 1999)。从衣壳蛋白外表面看，二聚体是现出向外垂直的菱形的形态（见图2）。这个突触的尖端多肽形成了衣壳抗原（HBc Ag）。5个和6个二聚体在5重轴和准6重轴处分别排列，和轴相对的菱形成一定角度，衣壳表面呈网状结构，有直径12-15的小孔，可以允许核酸自由进出衣壳的内部。图2.C端截短的乙型
14、肝炎病毒衣壳蛋白C的二聚体晶体结构（Wynne et al.,1999）。突触在图的右上方，衣壳蛋白腔体将在图的下方。52个暴露在衣壳表面的氨基酸单个置换成丙氨酸的突变表明，每个单体中的11个残基（黑球表示）的突变对于衣壳形成、病毒DNA在颗粒体内的合成都没有影响，但会阻断核衣壳的包膜化）（Porsel and Bruss，2003）。这些区域可能是出芽过程中与包膜发生相互作用的结合位点。这个精氨酸富积区不存在于晶体结构中，被认为是在病毒颗粒腔体中与病毒核酸相互作用造成的(Zlotnick et al., 1997)。然而，一个单克隆抗体可以直接作用于C蛋白的这个区域到乙肝病毒衣壳上(Mach
15、ida et al., 1991)，胰蛋白酶可以从重组的乙肝衣壳上截断大约一半的蛋白C (Lieder, 2002)。因此，似乎蛋白C的精氨酸富积区位于衣壳腔体内，但蛋白C的另外一些区域则位于衣壳的外表面一侧。在乙肝感染的细胞中，衣壳的组装是和结合有病毒P蛋白的病毒前体RNA基因组一起进行的(Bartenschlager and Schaller, 1992; Hirschet al., 1990)，并且有像分子伴侣之类的细胞因子参与(Beck and Nassal, 2003; Wang et al., 2002)，并且有在精氨酸富积区的丝氨酸蛋白激酶的磷酸化(Daub et al., 20
16、02; Kann and Gerlich, 1994; Kau andTing, 1998)。这个包装过程在低浓度的蛋白C得二聚体条件下进行，低于仅仅来自于C蛋白(Seifer et al., 1993)的衣壳形成时的浓度，这使前体基因组和复制因子进行有效地包装。近来发现一种低分子量复合物通过结合感染乙肝的蛋白使乙肝基因组核心蛋白不稳定，并且它还阻止衣壳的形成(Deres et al.,2003)。已经有了可能潜在的抗病毒药物在将来作用于慢性乙型肝炎。衣壳的解体也能被非抑制细胞的通路的肿瘤坏死因子诱导，并且在自然感染的抗病毒机制中有着重要作用(Biermer et al., 2003)。3、衣
17、壳的成熟过程当乙肝核衣壳形成后，它包含有一个RNA分子（前体基因组），然而分泌型的病毒粒子则包含有部分双链的环形的DNA，此DNA分子来自于病毒粒子腔的逆转录过程。实际上，在感染的细胞中可以发现有病毒DNA的合成，而在病毒粒子中则没有(Mason et al., 1982; Weiser et al., 1983)。因此，可以推测，不成熟的，含有RNA的衣壳在出芽过程中被排除，病毒DNA的合成是和衣壳的结构变化相联系的，只有成熟的衣壳结构才能有包膜的形成(Summers and Mason, 1982)，这个模型得到了实验的支持。许多在C端截短的DHBV核心蛋白在先于形成部分环状的双链DNA时
18、阻止核酸的合成，同样也抑制衣壳的包膜化过程(Yu and Summers, 1991)。当对HBV和DHBV逆转录酶的活性中心进行点突变，则使衣壳“冻结”在不成熟的状态。根据这个模型，包装和释放这些及壳则大幅度减少(Gerelsaikhan et al., 1996;Wei et al., 1996)。进一步的证据来自于使用一个同步的DHBV的复制系统，表明了包膜过程的竞争性，胞膜化仅晚于复制循环时间(Perlman and Hu, 2003)。这种选择性的外输成熟的核衣壳有着严格的调控。仅当竞争复制的衣壳体被包装到病毒粒子而且释放到血液中去。从而，特异性感染的DHBV和每个有感染力的病毒粒子
19、相似(Jilbert et al., 1996)。同时，对于HBV，小部分的有感染力的颗粒，它包含的衣壳组分也似乎非常地高(Barker and Murray,1972)。这种自然成熟的信号还不是很清楚。有一些证据表明，蛋白C的富积精氨酸的区域的磷酸化状态可能是此信号的一部分(Yuand Summers, 1994a,b)。然而，当磷酸化位点被丙氨酸，谷氨酸或天冬氨酸取代后也能影响前体基因组的包装和DNA的合成(Gazina et al., 2000)。因此，诱导一种直接影响蛋白C在衣壳的包膜过程中的磷酸化是非常困难的。有趣的是，当蛋白C的97位异亮氨酸点突变为亮氨酸后导致了不成熟的衣壳蛋白的
20、包装(Yuan et al., 1999)。这个残基在突触结构的内部结构中。很可能这种突变诱导了一种构型的变化，最终导致了构成早期的包膜化信号的表达。另外的点突点（P130T）发生在野生型(Yuan and Shih,2000)的回复突出，它在核心蛋白相当远的地方，则阐明了包膜的成熟信号。4、乙肝的包膜蛋白乙肝有三种包膜蛋白。它们从一个单一的开放阅读框表达，依基因型不同，分别含有389或400个的密码子(Heermann et al., 1984)。这个框架的转录发生于PS1启动于的上游并且带有一个内部启动子PS2 (Cattaneo et al., 1983)（图1）。这两个转录不需要被拼接
21、加工。发生于PS1启动子的翻译产生一个大的包膜蛋白L，含有389或400个氨基酸。发生于5端PS2的启动子转录并不完全一致，但大致分部于一个相当弱的启动子位于E的三联体109位处（或者120处，依基因型而定）。较长的PS2转录本位于这个起始密码处，然而，第一个位于较短的转录本的5端起始密码是位于更下游的55位三联体处。长的PS2转录本翻译产生中等大小的包膜蛋白M。另外，当这个5起始密码被核糖体忽略而识别第二个起始密码，则长266个氨基酸的较小的表面蛋白S就产生了(Sheu and Lo, 1992)。小的转录本PS2仅仅产生蛋白S。这个表达模型使得乙肝包膜蛋白有着相同的未端（见图1）。S区存在
22、于所有三种蛋白中。M的N未端的55个氨基酸（这里是L的中间部分），被称为前体S2，在L中独一无二的108或119个氨基酸被称作前体S1。鸟类的嗜肝DNA病毒的开放阅读框E缺少前体S2起动子，从而，这些病毒只产生两种包膜蛋白。衣壳蛋白在内质网中合成，并产生复杂的跨膜拓扑结构（见图3）。蛋白S定位于内质网膜，起始于N未端的1型定位信号（S的8-22位残为疏水性序列），它不被信号肽酶切割。第二种类型的信号（在S的80-90残基为疏水性序列），锚定于内质网膜，以这种方式，它的下游区域朝向于内质网腔(Eble et al., 1987)。它被猜测，这种N未端的信号，不是内源性的锚定作用，而是以这种方式混
23、合进脂质层，在23和79位残基处形成环，位于内质网的细胞质一侧。蛋白S的C末端57个氨基酸（170-226位）有很高的疏水性，他被认为在这个区域是包埋于内质网中的。拓扑基因信号序列在这个区域没有被发现。S蛋白的C末端朝向内质网腔，由于外源的融合体在S中会暴露于腔体内(Eble et al., 1987)。这个腔体环（99-169位氨基酸）在二次跨膜区域和疏水的C末端区域带有主要的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），在出芽后它位于病毒颗粒的外表面。在M蛋白中，尽管没有拓扑基因信号，前体S2结构域的N末端55个氨基酸还是出现在内质网的腔体内(Eble et al., 1990)。更进一步，M蛋白S
24、结构域的I型信号决定了前体S2的跨膜折叠和蛋白S的折叠是相似的。图3.乙型肝炎病毒包膜蛋白的跨膜拓扑学结构。蛋白S的跨膜折叠区域在N端的I型和内部的II型信号（空框表示）；C端区域为疏水区，被认为是包埋进脂双层中（水平空框表示）；C末端朝向内质网腔；N联聚糖残基结合于腔环上，用小叉表示。蛋白M的折叠方式与S蛋白类似，N-联糖基化的pre-S2位于内质网腔。L蛋白具两种拓扑结构。开始时pre-S结构域均位于胞质内（i-preS），约有一半的L蛋白会在翻译后重折叠，而将pre-S结构域转移进内质网膜的腔内一侧（e-preS）。L蛋白pre-S结构域内潜在的N-联糖基化位点用星号表示，S蛋白的胞质环
25、和i-preS结构域的某些区域可能在出芽过程时与衣壳相互作用，用方框表示。蛋白L的N末端的前体S1也没有任何关于共翻译后定位于内质网的信号。很明显，第一个来自于核糖体的在L合成期间的拓扑基因信号是S结构域的I型信号，并且这个信号似乎在多肽链的内部没有作用。因此，蛋白L插入到内质网膜开始于S结构域的II型信号，并且前体S1、前体S2和S结构域的N末端仍旧保持在内质网膜的细胞质一侧（见图3）。奇特的是，在翻译后，L链的一半跨膜拓扑区域产生了巨大的改变(Bruss et al.,1994; Ostapchuk et al., 1994; Prange and Streeck, 1995)。相同的现象
26、也发生在DHBV的L蛋白中(Guo and Pugh, 1997; Swameye and Schaller, 1997)。在再折叠的链中，前体S结构域出现在内质网的腔体一侧，它被认为在这种折叠中，在S结构域的I型信号的疏水区通过膜的情况和M及S蛋白是相似的。L蛋白的这两个构象有着独特的作用：e- preS结构域暴露在病毒粒子的表面并参与病毒受体的结合(Urban and Gripon,2002)；同时，i- preS在与核壳的联系中有重要作用。另外，i- preS还可以激活多种启动子元件(Hildt et al., 1996),但其意义仍不清楚。拓扑结构的改变机制也没有被很好的阐明。细胞质分
27、子伴侣Hsc70和细胞质的前体S1及缺失结合位点的前体S1结合，导致了共同翻译定位的区域，表明了分子伴侣在细胞质中修复了该链(Lambert and Prange, 2003;Loffler-Mary et al., 1997; Prange et al., 1999)。人们猜测病毒包膜蛋白的二聚体形成了通道，这可以被前体S1结构域定位所利用。然而，实验并没有证实这样的通道确实存在。对于HBV， S和M蛋白的转运过程被忽略了(Lambert andPrange, 2001)，但在DHBV中，S蛋白是必需的(Grgacic, 2002; Grgacic et al., 2000)。合成后不久，H
28、BV的三种包膜蛋白形成二硫键，同源地或异源地，没有任何特异性配对地特征(Mangold et al., 1995;Wunderlich and Bruss, 1996)。在蛋白S的结构域，在14个半胱氨酸中多于1个的位置形成键桥。前体S结构域不包含半胱氨酸残基。三种包膜蛋白地S结构域在146位的天冬氨酸处有部分地N-联糖基化(Peterson et al., 1982)。因此，这种蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中表现出大约3KDa的分子量差异。M蛋白的前体S2在4位的天冬氨酸处有N-联糖基化(Stibbe and Gerlich,1983)。在L蛋白中，该位置不被修饰，前体S1其
29、它的潜在糖基化位点在4位的天冬氨酸（或15位）也不会被修饰，因为这些位点在蛋白质合成时位于内质网的细胞质一侧。人工地把I型转运信号融合到L蛋白的N端使它们共同翻译后进行转运，导致了前体S的这两个位点糖基化(Bruss andVieluf,1995)。蛋白L在2位的甘氨酸处被豆蔻酸化(Persing et al.,1987)。许多模型因此显示，蛋白L的N未端插入内质网或者病毒的膜内。然而，还没有实验证据证明这种猜测，并且脂肪酸部分位于一种蛋白质的环境里。这种蛋白L的共价修饰似乎在感染的过程中表现出重要的作用(Bruss et al., 1996; Gripon et al., 1995)。DHB
30、V的蛋白L被部分地磷酸化(Grgacic and Anderson, 1994)，主要位于118位的丝氨酸上(Borel et al., 1998)。然而，突变分析不能够阐明这个修饰达程在DHBV的生活史中的主要作用(Grgacic et al., 1998)。乙肝蛋白L的磷酸化还没被发现。5、亚病毒脂蛋白颗粒乙肝包膜蛋白在质膜中并不出现，尽管它们能从后内质网，前高尔基体中(Huovila et al., 1992; Patzer et al., 1986)有效地出芽(Eble et al., 1986; Simon et al.,1988)，但它们不参于衣壳形成而形成球状的或纤维的亚病毒脂蛋
31、白颗粒，并且分泌到血液中去。这些颗粒直径20nm，纤维状结构的长度不等。亚病毒颗粒的浓度比血液中的多1万倍左右。这种过量产生空包膜的现象还不清楚。推测这种现象是作为宿主免疫系统的诱饵。实际上，亚病毒颗粒和病毒粒子有着相同的表面抗原（HBSAg），尽管它们的包膜蛋白组成并不是完全一样。球形亚病毒颗粒由仅为接近100个蛋白链的L蛋白组成，相对的蛋白L数量在纤维体中还要多些，在病毒粒子的包膜中最多(Heermann et al.,1984)。分离表达蛋白S于酵母中，可以在细胞内产生20nm的HbsAg颗粒，这种材料有很高的免疫原性，可以作为乙肝的有效疫苗(McAleer et al., 1984)。
32、单独表达蛋白S于哺乳动物细胞，则有效分泌产生直径为20nm 的HBsAg颗粒。这个形态学的过程机制并不清楚。分子伴侣Calnexin (Xu et al., 1997a)和BiP (Cho et al., 2003)可能参与其中。在亚病毒颗粒中，脂的相对量为25% (Gavilanes et al.,1982)，这与通常所说的双层脂膜不太一样。更进一步，脂的一个早期的形成于20nm 的颗粒形成过程中。点突分析，当蛋白S的腔环中的4个半胱氨酸中的3个残基突变为丝氨酸后，则颗粒不会形成(Mangold and Streeck, 1993)，然而，这些位点的共价修饰，例如，脂肪酸的酰化还没有被发现(
33、Persing et al., 1987)。共同表达蛋白L和S，导致了一种剂量依靠的颗粒释放抑制(Ou and Rutter,1987; Persing et al., 1986)。亚病毒颗粒贮存于内质网腔内(Xu et al., 1997a)，在转基因小鼠中可以产生细胞应答，甚至细胞死亡和癌变(Chisari and Ferrari,1995; Xu et al., 1997b)。贮存的细胞内HBsAg也在人类慢性乙肝的形成中起着一定的作用(Foo et al., 2002)。这种贮存现象已经得到了广泛的观注，然而，它在病毒生活史中的意义还不是很清楚。受体甘氨酸基的点突变阻止肉豆蔻酰化或缺失
34、N未端的分泌抑制的19个氨基酸(Gazina et al., 1996;Kuroki et al., 1989; Prange et al., 1991)。融合的I型分泌信号到蛋白L中和前体S的共翻译则会运输到内质网腔内，从而，产生2个中的其中之一的蛋白L的拓扑结构，其可以消除分泌抑制(Bruss and Vieluf, 1995)。这些对于DHBV的蛋白L则不然(Gazina et al., 1998)。宿主蛋白还没有发现组成到亚病毒颗粒中去，这表明在形态发生过程中这些蛋白被有效地排除了。即使共表达HBV和DHBV的蛋白S，也不会导致混合的亚病毒颗粒(Gerhardt and Bruss,
35、1995)，虽然它们具有清楚的结构和序列用源性（氨基酸同源性达25%）。然而，哺乳动物病毒WHV和HBV，它们相当地类似，共同包装。这表明20nm 颗粒的形成需要在蛋白亚基之间有着严密的结合。可以想象，亚病毒颗粒的出芽过程也反映出病毒粒子的相同过程。然而，关于20nm的颗粒从膜上的释放知道之甚少，仅是一种猜测。仅仅猜测亚病毒颗粒和病毒粒子的出芽处的膜组成相同。 6 衣壳的胞膜化过程嗜肝病毒的成熟核壳定位于细胞质，随后发生的包膜化过程很难通过电子显微镜等手段直接进行观察，因此，病毒衣壳获取其包膜的机制尚不清楚。虽然HBV包膜对温和型去污剂敏感，对于病毒包膜中是否含有脂质仍不清楚。至今为止，只是证
36、明在20nm的HBsAg亚病毒颗粒中含有脂质。但通过与其他包膜病毒的比较以及对嗜肝病毒粒子形成在分子水平上的分析，可以推测HBV病毒粒子是由衣壳在细胞内膜进行常规的出芽所形成。Post-ER、pre-Golgi膜的某些位点具病毒包膜蛋白，可能是病毒出芽所在地,但病毒衣壳如何转运至这些位点尚不清楚(Huovila et al., 1992; Patzer et al., 1986)。在DHBV中，含dsDNA和非高度磷酸化的核心蛋白的成熟衣壳可与膜结合，该过程不依赖病毒包膜蛋白(Mabit and Schaller, 2000)。不成熟、高度磷酸化且含ssDNA的衣壳则不能与膜结合。这些现象表明
37、，出芽过程中成熟衣壳与不成熟衣壳的筛选不是靠衣壳与包膜蛋白的相互作用，而是依赖衣壳与膜的相互作用，且成熟衣壳可在膜上侧向运动至出芽位点。最近有报道称，一些包膜病毒的结构蛋白具所谓的late 结构域，在出芽过程中参与与宿主因子的相互作用 (Freed, 2002; von Schwedleret al., 2003)。通过这种相互作用，病毒得以接近宿主出芽装置。HBV C蛋白在衣壳表面有一序列PPAY（129-132位氨基酸）(Wynne et al., 1999)，符合已知的late 结构域的序列PPXY。将129、130和132位的残基突变成丙氨酸会阻断HBV衣壳形成，而131位残基的突变则
38、对病毒衣壳或病毒粒子的形成没有任何影响，因此还不能确定这些残基在出芽过程中是否具有直接的重要的作用(Ponsel and Bruss, 2003)，还需要设计更多的实验来确定HBV是否利用late 结构域介导途径出芽。 HBV衣壳的包膜化依赖病毒包膜蛋白(Bruss and Ganem, 1991; Summers et al.,1991; Ueda et al., 1991)。与C型反转录病毒或慢病毒（lentivirus）不同，阻断包膜蛋白表达的HBV突变体不能释放脂双层包裹的衣壳。在一个不能表达M蛋白的患者身上确认，一个HBV自然点突变表明M蛋白不是必须的(Fernholz et al.
39、, 1991)。而L或S蛋白表达被抑制则会阻断病毒粒子的形成(Bruss and Ganem, 1991; Ueda et al., 1991)，这些结果表明：（i）L和S蛋白异源多聚物的形成（也可和M蛋白一起）会导致亚病毒颗粒出芽被抑制，同时，因L蛋白对分泌的抑制作用，S蛋白也滞留在细胞内膜。（ii）病毒衣壳可解除对分泌作用的阻断。（iii）包膜化过程由S蛋白的出芽能力所主导。但是，N端截短的L蛋白突变体能与野生型L蛋白一样有效的形成病毒粒子(Bruss and Thomssen, 1994)。另外，20nm HBsAg亚病毒颗粒的出芽机制能在多大程度上反映病毒粒子的出芽过程也还不清楚。对L
40、蛋白在病毒粒子形成中的功能的一点提示来自该蛋白的跨膜拓扑学结构。在L蛋白的N端融合分泌信号，从而只产生一种跨膜拓扑学结构的L蛋白，将前体S结构域转移至ER腔（e-preS）。该L融合蛋白能被组装进入亚病毒颗粒(Prange et al., 1995)但不能形成病毒粒子(Bruss and Vieluf, 1995)。亚病毒颗粒的形成和分泌可作为HBV包膜蛋白正确折叠和参与病毒粒子形成的指标。L蛋白将前体S结构域暴露在ER胞质一侧（i-preS）对于核壳的包膜化非常重要。表明L蛋白前体S结构域含有一些区域能介导与衣壳的联系。与i-preS结构域具基质蛋白功能相一致，胞质内DHBV衣壳的细胞内途径
41、受DHBV L蛋白的影响 (Summers et al.,1990; Summers et al., 1991)。当L蛋白不存在时，衣壳将进入细胞核，将其基因组释放至核质；当L蛋白表达达到一定的阈值，衣壳将以有包膜的病毒粒子形式被释放。DHBV L蛋白的这个功能可归于161个氨基酸长的前体S结构域的116-137位氨基酸(Lenhoff and Summers, 1994)。HBV的 i-preS中也发现了一个短的类似的区域103至124位氨基酸（或92-113位氨基酸，与病毒基因型有关）。该区域的小氨基酸的替换会阻断病毒粒子的形成，但L蛋白仍能被组装进入亚病毒颗粒(Bruss, 1997)，
42、甚至连更细微的突变如将两个相邻的氨基酸换成丙氨酸，也会阻断核壳的包膜化。但该结构域的上游区域可被缺失，而不影响病毒粒子的形成(Bruss and Thomssen, 1994)；下游的大多数区域直至S结构域内II型信号的跨膜区的突变也没有任何影响(Bruss,1997)。第二个暴露在ER胞质一侧的包膜蛋白结构域是S蛋白跨膜区的环状结构。遗传学分析显示该环靠近C端的一半区域内的短片断的缺失会抑制病毒粒子的形成，但不抑制20nm亚病毒颗粒的形成(Loffler-Mary et al., 2000)，但该区域内的点突变不具这种效应(V. Bruss, unpublished)。在没有微粒体存在时，进
43、行体外的N端或C端截短的L蛋白与E.coli来源的病毒衣壳的体外结合实验。实验表明，L蛋白的两个片段（一个从24至191位氨基酸；一个从191至322位氨基酸）在衣壳的结合中具有协同作用(Tan et al., 1999)。因此，我们推测在出芽时上述两个片段或其中的一个作为基质结构域直接与病毒衣壳结合，这类似于病毒E2蛋白的胞质尾在粒子形成中的作用(Cheng et al., 1995)。通过突变体分析，对衣壳上可能的结合位点进行了定位。对核心蛋白随机插入和缺失突变体的初步筛选确定了一些突变体(Koschel et al.,1999)，他们均能完成前体基因组的包装、衣壳的组装和病毒DNA的合成
44、，但会阻断核壳的包膜化(Koschel et al., 2000)，相似的表型在分离自慢性病毒携带者的自然发生HBV突变体中也有发现(LePogam et al., 2000)。在基于HBV衣壳晶体结构的更深层次的筛选中，52个暴露在衣壳表面的氨基酸被换成丙氨酸(Ponsel and Bruss, 2003)。11个突变体特异性引起核壳包膜化的缺失（图.2），它们成簇地定位在突触的基部或突触之间的凹处。突触中间区域或顶部的突变则没有影响。但是，HBV从转染细胞中的出芽可被一个经肽库筛选所得的多肽所抑制，且该多肽能与突触顶部结合(Bottcheret al., 1998; Dyson and M
45、urray, 1995)。可能这种抑制效应是由空间障碍所引起，而不是由于包膜与衣壳间特异性相互作用被阻断。人们认为包膜蛋白的其中一个或两个基质结构域可直接与衣壳表面的一个或两个结构域结合，这点在HBV的一个双重突变体中得到了证实。在该突变体中，核心基因I97L突变会引起相对未成熟的衣壳包膜化，而L蛋白基质结构域内A119F突变可抑制I97L的突变效应(Le Pogam and Shih, 2002)。另外，来自HBV包膜蛋白和衣壳的多肽的体外结合实验也同样证实了这点(Poisson et al., 1997)。在体外结合实验中，肝组织来源的病毒衣壳和重组衣壳都能与对应于L和S蛋白基质结构域的多
46、肽较好的结合(Hourioux et al., 2000)，这表明衣壳与包膜蛋白的相互作用可能并不能区分成熟和未成熟的衣壳。在描述20nm亚病毒颗粒形成的章节中有提到：嗜肝病毒包膜蛋白的组装过程具有选择性，尚没有发现任何的外源蛋白被组装进亚病毒颗粒，即便是禽类或哺乳类来源的包膜蛋白也不能混合组装。这在病毒粒子的包膜中也是一致的。WHV的L蛋白可以代替HBV L蛋白参与HBV病毒粒子的形成尽管效率较低，而DHBV 的L蛋白则不行(Gerhardt and Bruss, 1995)。这与WHV比DHBV在L蛋白基质结构域上与HBV具有更高同源性的事实相符合。不过，通过融合S蛋白N端将外源结构域组装
47、进HBV包膜是可行的(Bruss and Ganem, 1991)。另外，需将分泌信号融合在蛋白N端以确保外源结构域被转运至ER腔。所产生蛋白的构象与用外源序列取代前体S2结构域的M蛋白构象相似。该融合体与HBV在细胞系中的共表达可产生表型混合的病毒，并将外源结构域暴露在病毒粒子表面。一种被称为丁型肝炎（HDV或delta virus）的缺损病毒可增殖性感染仅HBV感染的肝细胞 (Taylor, 2003)，因为HDV可利用HBV的包膜。HDV核壳由一环状ssRNA和HDV编码的具长短两种形式的蛋白组成（delta 抗原），环状ssRNA因为分子本身可以互补配对而具双链构象。球形核壳的结构尚哺
48、清楚，较长delta 抗原在C端比短的delta抗原多19个氨基酸，且在该区域含异戊二烯化（isoprenylation）信号。异戊二烯化对于HDV核壳的包膜化很重要。与HDV病毒粒子形成过程不同(Hwang and Lai, 1993)，在HDV病毒粒子形成过程中，HBV 的S蛋白很充足(Wang et al., 1991)。L蛋白对于HDV的感染是必须的。这些结果表明HDV和HBV衣壳包膜化的分子机制是不同的，尽管它们利用相同的包膜蛋白。参考文献：Acs, G., Sells, M.A., Purcell, R.H., Price, P., Engle, R., Shapiro, M.,Popper, H., 1987. Hepatitis B virus produced by transfected Hep G2 cells causes hepatitis in chimpanzees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.84, 46414644.Barker, L.F., Murray, R., 1972. Relationship of virus dose to incubation time of clinical hepatitis and time of appearance of hepatitis-associate
