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1、实验五 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）,1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤 5.实验结果与讨论,实验目的,学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。,实验原理,用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。,实验仪器、材料与试剂,（一）仪器 1.恒温摇床 2.超净工作台 3.高压灭菌锅 4.低温离心机 5.微量取液器,（二）材料 大肠杆菌DH 5。,（三）试剂
2、1.LB液体培养基 2.0.1mol/L CaCl2溶液,实验步骤,1.挑取大肠杆菌DH 5的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37振荡培养14hr。2.取2mL菌液加入100ml LB液体培养基中，扩大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5时，停止培养。3.菌液冰上放置10min，无菌条件下移入50ml Beckman离心管中，4，3,500rpm，离心5min。,4.弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放置5min。5.4，3,500rpm离心5min。6.弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新悬浮细胞，200L/份分装到预冷的无菌Ep 管中，4保存备用。（如加入15%的甘油，-70保存，可保存一年）。,实验结果与讨论,感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。,
