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1、第五节、放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA),一、基本概念,放射免疫测定（RAI）：根据抗原抗体特异性结合的原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。,同位素（isotope）：元素周期表中处于相同位置的某种元素所包含的若干种核素。,放射性核素（radionuclide）：由于核内中子数和质子数的比例不适而自发地发生核衰变，在衰变过程中将放射出一种或几种射线而转变为别种核素的不稳定核素。,1959年 Yalow和Berson建立放射免疫测定（RIA）1960年 竞争性蛋白结合分析（CPBA）1968年 Miles和Hales
2、建立免疫放射量度分析（IRMA）1968年 放射受体分析法(RRA)1971年 Addison和Hales建立双位点或夹心IRMA,RIA方法学研究进展,基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的待检抗原（Ag）同时与限量的特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑制反应，通过测定结合（*Ag-Ab）的或游离（*Ag）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。RAI属超微量分析技术，常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。,二、RIA原理,Ag*Ag Ab Bound Free B F B/F,竞争放射分析原理示意图,125I的优点,29种同位素，125I
3、最为常用；半衰期适中(60天)，易于商品化和储存，也利于废物处理；发射低能35kV 线易于测量，井型闪烁效率高；不发射粒子，标记物自分解速度低；标记过程中，标记物免疫损伤小；化学性质活泼，标记Ag和Ab容易，可得到多种标记物而广泛应用。,二、RIA操作程序,配制已知浓度系列标准抗原（Ag）加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）-温育加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）-温育分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F）用计数器测量放射性计数根据标准曲线或计算机直接算出,动态平衡体系中:*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力*Ag和Ab的量恒定 Ag+*Ag的分子数大于抗体的分子数*Ag与Ag相互竞
4、争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系测抗原（Ag）和抗体（Ab）-温育,结合抗原(B)与游离抗原(F)分离方法,三、RIA法标准曲线,标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。这种曲线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的特定函数关系，也称为剂量反应曲线。标准曲线的手工绘制形态 标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同，或所采用坐 标系统不同而有不同的形态。标准曲线的基本数学函数式 放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是双向性的，服从质量作用定律。,RIA竞争抑制曲线类型注：横坐标为标记抗原（*Ag）的浓度,四、建立放射免疫分析方法的必备条件,
5、对标准抗原的基本要求(1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致。(2)抗原必须纯度高。(3)标准抗原的量必须准确。(4)标准抗原应有很好的稳定性。对抗血清的要求 抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。检查抗血清质量的指标主要 有亲和常数(K)、免疫交叉反应率及滴度(或抗体效价)。对标记抗原的要求(1)标记抗原的免疫活性与待测抗原及标准品必须一致。(2)标记抗原要有适当高的放射性比活度。(3)标记抗原应具有足够高的放射化学纯度,衡量抗体质量的指标,亲和力:抗体结合的强度是RIA的前提特异性:不受交叉反应物质影响的程度滴度:抗体的效价抗体实际应用时的稀释倍数,五、放射免疫分析的设计方法,标讥抗原和抗
6、体用量最佳化设计:1、标记抗原用量选择。2、抗血清的使用滴度选择及其方法。标准抗原剂量设计 1、标准抗原剂量范围 2、标准曲线工作范围 加样顺序设计 反应介质 反应容积与温度及时间 1、缩小反应容积可相应减少抗体和标记抗原的绝对用量，使非标记抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵敏度。2、抗原、抗体结合反应的平衡结合常数K与温度有关，必须通过实验来确定最佳工作条件。与F分离方法选择 样品采集与保存,六、放射免疫分析的质量控制,误差和放射免疫误差的来源(1)误差及其分类(2)放射免疫分析误差来源 掌握质量控制与质控样品(1)放射免疫分析的质量控制内容(2)质量控制样品 质量控制指标：灵敏度、精密度、偏倚和准确度、特异性、稳定性、临床有效性。实验室内部质量控制：精密度的评价、批内偏倚的评价和批间重现性评价。实验室间的外部质量评价。,(一)、液相法,七、RIA技术类型和应用,1.直接法IRMA示意图,（二）、固相法,2.双位点法IRMA示意图,八、免疫放射分析（IRMA）,基本原理：用过量的核素标记抗体与待测抗原形成复合物，并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段除去多余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。,双位点IRMA,单位点IRMA,
