高效液相色谱培训教案ppt课件.ppt

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1、高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography,青海大学分析测试中心 李德英,第一章 绪论第二章 高效液相色谱基本概念第三章 高效液相色谱仪构成介绍第四章 高效液相色谱方法及原理第五章 高效液相色谱方法的建立及应用,第一章 绪论第一节 高效液相色谱的特点第二节 高效液相色谱的分类第三节 高效液相色谱的应用范围和局限性,第一节 高效液相色谱的特点,高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在20世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。20世纪50年代后气相色谱法

2、在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起，而液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间很长，因而未受到重视。20世纪60年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现，人们又重新认识到液相色谱法可弥补气相色谱法的不足之处。因此，在20世纪60年代后，高效液相色谱技术才有了很快的发展。,高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）还可称为高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（

3、high resolution liquid chromatography）或现代液相色谱（modern liquid chromatography）。,11906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离见图示 2、20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛的应用。3、3040年代发表了薄层色谱、纸色谱的论文 4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、吸附色谱和电泳领域取得了成果 5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱 6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求,一、色谱法（chromatograph）的

4、起源和发展,图示,固定相CaCO3颗粒流动相石油醚,植物色素混合物,7、70年代HPLC崛起，气相色谱和高效液相色谱，逐步成为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领域。8、1975年，美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品化的离子色谱仪问世。9、1979年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非抑制型离子色谱仪。10、20世纪80年代以后，一种新型的色谱技术毛细管电泳技术随之出现。11、20世纪90 年代以后，ELSD一种新型的检测器出现，改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。12、20世纪90 年代中期以后，用于HP

5、LC的MS检测器开始普及，使液相进入定性的时代。,进入21世纪，HPLC在多个方面取得突破：Merck商品化的一体化柱，给人们一种全新的色谱柱概念。2004年，Waters提出了UPLC的新概念，超高压液相色谱。借助小颗粒的填料，特殊化的设计，实现超高效和快速、高通量的分析。2004年10月13日，ESA公司向外界宣布了一项高效液相色谱的最新技术突破，Corona带电气溶胶检测器（CAD）诞生，新一代的通用型检测器。2005年，岛津发布了第一个基于Web的HPLC系统。HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。,二、色谱法定义、分离基础和目的,定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流

6、 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动，最终达到分离的目的。图例分离基础：差速迁移(例:赛跑)目的：多组分分离，实现定性定量分析,图示,分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开,碳酸钙吸附剂,石油醚流动相,色素,三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较,1.HPLC与经典LC的比较,从分析原理上讲，高效液相色谱法和经典液相（柱）色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。,三、高效液相

7、色谱与其它色谱方法的比较,1.HPLC与经典LC的比较,经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间很长。高效液相色谱法使用全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。,三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较,1.HPLC与经典LC的比较见下表,2.HPLC与GC的比较,高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，

8、分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸汽压低、沸点低的样品，而不适于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析，此两种方法的比较如下：不同色谱方法适用的分子量范围,2.HPLC与GC的比较,相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测,与经典液相色谱法相比,颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵

9、敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。,四、高效液相色谱法的特点,与气相色谱法相比,不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。,优点：“三高”、“一快”、“一广”,缺点：,按分离机制分类：分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法 空间排阻色谱法,第二节 HPLC分类,基本类型色谱法的分离机制 对于不同的分离机理，K的含义不同。吸附色谱 吸附系数 分配色谱 分配系数 离子交换色谱 离子交换系数 统称K 分子排阻色谱 分子排阻系数,1.吸

10、附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。,3.离子交换色谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.空间排阻色谱（凝胶色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶

11、；,（一）吸附色谱法,要求：固定相吸附剂（硅胶或AL2O3）具表面活性吸附中心分离机制：见图示,吸附系数,注：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质 及温度有关 next,吸附平衡 Xm+nYaXa+nYm,图示,分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开 back,（二）分配色谱法,要求：固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互溶 载体惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应分离机制见图示,分配系数,注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关 next,图

12、示,分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离,连续萃取过程 back,分配色谱法分类,正相分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性反相分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性,正相分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）,反相分配色谱：极性强的组分先出柱。,（三）离子交换色谱法,要求：固定相离子交换树脂 流动相水为溶剂的缓冲溶液被分离组分离子型的有机物或无机物分离机制见图示,选择性系数,阳离子交换树脂 RSO3-H+X+RSO3-X+H+,注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关 next,图示,分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能

13、力（亲和力）不同而实现分离 back,（四）空间排阻色谱法,要求：固定相多孔性凝胶 流动相水凝胶过滤色谱 流动相有机溶剂凝胶渗透色谱 分离机制见图示,渗透系数,注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关 next,图示,分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离 back,结论：,四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡 K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和 渗透系数,除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶 孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流 动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响,按

14、固定相的固定方式分：,按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类：洗脱法 前沿法置换法,洗脱法（elution method）又称淋洗法，将含有不同组分的样品注入色谱柱，流动相连续流过色谱柱，并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别，而顺序流出色谱柱。前沿法（frontal method）又称迎头法，如将含三个等量组分的样品溶于流动相，组成混合物溶液，并连续注入色谱柱，由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与固定相作用最弱的第一个组分首先流出，其次是第二个组分与第一个组分混合流出，最后是与固定相作用最强的第三个组分与第二个组分和第一个组分混合一起

15、流出。此法仅第一个组分的纯度较高，其他流出物皆为混合物，不能实现各个组分的完全分离。置换法（displacement method）又称顶替法，当含有三种组分的混合物样品注入色谱柱后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用一般流动相无法将他们洗脱下来，为此可使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂（或称顶替剂）作流动相，当他注入色谱柱后，可迫使滞留在柱上的各个组分，依其与固定相作用力的差别而依次洗脱下来，且各谱带皆为各个组分的纯品。,第三节 高效液相色谱法的应用范围和局限性,一、应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质

16、和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。依据样品分子量和极性则要选择相应的HPLC分离方法。,化学、生物学和医学等应用广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多(80%)是通过HPLC来完成的。,应用,各种HPLC方法的应用范围及对象,二、方法的局限性,高效液相色谱法虽具有应用范围广等的优点，但也有下述局限性：1、在高效液相色谱法中，

17、使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。2、高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器（热导检测器和氢火焰离子化检测器）。3、高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求柱效高达10万块理论塔板数以上，必须用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。4、高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变形的具有生物活性的生化样品。,综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相色谱

18、法的特点，使用范围和局限性的前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在解决实际分析任务中发挥重要的作用。,第二章 高效液相色谱基本概念,一、什么是高效液相色谱？二、色谱过程三、常用的基本术语,High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法，简称：HPLC。是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器。广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段。,一、什么是高效液相色谱？,二、色谱过程,色谱过程：指物质分子（被分离组分）在相对运

19、动的 两相（流动相和固定相）中的“分配”平衡过程,以吸附色谱为例见图示色谱过程：吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离,图示,吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出,组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。,三、常用的基本术语,1、流出曲线和色谱峰2、基线、噪音和漂移3、峰宽柱效参数4、峰高和峰面积定量参数5、保留值定性参数6、分配系数和容量因子相平衡参数7、等温线8、分离因子和分离度分离参数,1流出曲线和色谱峰,流出曲线（色谱图 chromagtogram）：电信号强 度随时间变化曲线色谱峰(peak

20、)：流出曲线上突起部分,2基线、噪音和漂移 base line,noise and drift,基线：仅有流动相通过检测器时产生 的信号曲线。反映检测器噪音 随时间变化的曲线（稳定平直直线）噪音：仪器本身所固有的，以噪音 带表示（仪器越好，噪音越小）漂移：基线向某个方向稳定移动（仪器未稳定造成）,3峰宽 peak width：色谱柱效参数,峰宽W：色谱峰两侧拐点切线与基线相交的截距,标准差：为正态分布曲线两拐点间距离的一半。对应0.607h处峰宽的一半注：小，峰窄，柱效高半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽,注：除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积,图示,峰高(peak height；h)：组

21、分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。,4峰高和峰面积：色谱定量参数,5保留值：色谱定性参数,保留时间 retention time,tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间死时间dead time,t0：不被固定相滞留组分的保留时间，相当于流动相到达检测器所需要的时间,调整保留时间tR：组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱中多停留的时间，即组分在固定相中滞留的时间。等于组分的保留时间与死时间之差值,表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数,（1）时间表示的保留值,图示,续前,

22、保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需要的 流动相的体积。VR与tR和Fc（流动相流速mL/min）的关系,死体积V0：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间 体积。包括从进样器到色谱柱导管的体积、固定相的孔隙及颗 粒间隙、柱出口导管及检测器内腔体积的总和。,（2）用体积表示的保留值,续前,调整保留体积VR：保留体积与死体积之差，即组分 停留在固定相时所消耗流动相的体积,6分配系数和容量因子：相平衡参数,分配系数K（partition coefficient,平衡常数）：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比,注：K为热力学常数 与组分性

23、质、固定相性质、流动相性质及温度有关 实验条件固定，K仅与组分性质有关不同分离机理的色谱中，K名称虽有所不同，但物理意义都 一样，表示平衡状态下两相中浓度之比,讨论：色谱条件一定时，tR主要取决K的大小（色谱法基本的定性参数）,分配系数K不容易获得，不常用,tR（保留时间）与K（分配系数）的关系：,容量因子（capacity factor,容量比，分配比）k：在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量比,色谱分离前提各组分分配系数不等,注：应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等,2）色谱条件（s，m，T）一定时，K一定 tR一定,7、等温线：,定义：指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在

24、两相 中的浓度关系曲线，即cs对cm的关系曲线 图示,(1)线性等温线（理想）对称峰(2)非线性等温线凸形拖尾峰（常见）凹形前沿峰,固定相表面活性吸附中心未达饱和，K一定，与溶质浓度无关,固定相表面吸附中心活性不均，溶质分子先占据强吸附中心再占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小,溶质与固定相作用，改变其表面性质，K随着溶质浓度的增加而增加,斜率=K,线性：对称峰,凹形：前沿峰,凸形：拖尾峰,对称因子：（拖尾因子）,fs在0.951.05之间,fs小于0.95,fs大于1.05,对称因子(symmetry factor)衡量色谱峰对称性,8.分离因子和分离度：分离参数 描述相邻组分分离状态

25、的指标,（1）分离因子（分配系数比或选择性系数）定义：两种物质调整保留值之比,分离因子1是色谱分离的必需条件,（2）分离度（resolution,R）：衡量色谱分离条件优劣的参数定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍,讨论,设色谱峰为正常峰，W1W2=4,第三章 HPLC仪器介绍,高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压 输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置进样系统：进样器，进样阀分离系统：色谱柱，恒温箱检测系统：检测器数据处理和计算机控制系统：记录装置、色谱工作站,1、贮液器和吸滤器：,一、高压输液系统,贮液器:0.5-2L的玻璃瓶,溶剂吸滤器:Ni合金，孔约0.45 m，防止颗粒物进入泵内。

26、,流动相贮器俗称贮液瓶，它对大多数有机化合物呈化学惰性，耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料，容量约为0.5L2.0L，通常无色透明，若流动相需避光，有棕色瓶供选择。贮液瓶放置位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的改变和防止空气中的O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中。,2、高压输液泵,一、高压输液系统,要求,流量准确可调、可调范围宽：流动相流速在0.5-1.5mL/min，输液泵的最大流量5-10mL/min耐高压：输出压力常达30-60MPa液流稳定。结构材料应耐化学腐蚀,活塞型往复泵液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵,双活塞型往复泵,一、高

27、压输液系统,在线真空脱气装置,3、脱气装置：,将相对分子量小的气体从溶剂中除去,流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其中溶解的气体。在装入贮液瓶之前必须经过0.45m或0.22m滤膜过滤。在洗脱过程中如存在气泡会增加基线噪音，严重时使分析灵敏度降低。此外溶解在流动相中的氧气，会造成荧光猝灭，影响荧光检测器的检测，还可能导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有如下几种：,1超声波振动脱气 将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中，用超声波振荡1030min。此法较简单、常用。2抽真空脱气 用微型真空泵，降压至0.050.07Mpa既可除去溶解的气体，使

28、用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可以一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂的体系脱气。对于多元溶剂体系，每种溶剂应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。,3.加热回流脱气 用于需要彻底脱气的流动相（电化学检测器），因为使用了回流冷凝器可减少挥发性组分的损失。此法的脱气效果较好，不提倡用于混合流动相。4.吹氦脱气 使用在液体中比空气溶解度低的氦气在0.1Mpa压力下，以60mL/min的流速缓缓地通过流动相1015min，赶去溶入的气体。此法适用于所有的溶剂，脱气效果较好，但价格较贵。5真空在线脱气 把真空脱气装置串接到贮液系统中

29、，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法可适用于多元溶剂体系。,一、高压输液系统,4、梯度洗脱装置：,为什么要进行梯度洗脱？,使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离,梯度洗脱：在分离过程中逐渐改变流动相组成，如溶剂的极性、离子强度、pH值等。,一、高压输液系统,高压梯度：用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器,一、高压输液系统,低压梯度：只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。,二、进样系统,将样品溶液准确送入色谱柱的装置 手动方式、自动方式,密封性好、死体积小、重复性好、进样时引起色谱系统的压力和流量

30、波动要很小。,进样器要求,常用手动进样器六通阀进样器,二、进样系统,六通阀进样,Load,Inject,自动进样装置 采用微处理机控制进样阀采样（通过阀针）、进样和清洗等操作。操作者只需把装好样品的小瓶按一定次序放入样品架上（有转盘式、排式），然后输入程序（如进样次数、分析周期等），启动，设备将自行运转。,三、色谱分离系统 色谱分离系统包括保护柱、色谱柱、恒温装置和连接阀等。分离系统性能的好坏是色谱分析的关键。1、保护柱 为保护分析柱挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒，常在进样器与分析柱之间装上保护柱。保护柱是一种消耗性柱，一般只有5cm左右长，在分析50100个比较脏的样品之后需要换新的保护柱

31、芯。保护柱用分析柱的同种填料填装，但粒径要大得多，便于装填。,三、色谱分离系统,柱长1530cm，内径45mm,基质(硅胶或高分子聚合物微球),功能层(固定在基质表面对样品分子保留起实质作用的有机分子或功能团),2、色谱柱,常见色谱柱的类型专业的液相色谱仪厂家都有色谱柱生产，除此外还有很多专业的色谱柱厂家。C18又称ODS柱，使用最普遍、规格多，适合大多数化合物的分析，市场上品种繁多，值得注意的是同样的C18柱，得到的结果可能非常不一致，尤其是极性或离子化合物。流动相为甲醇（乙腈）水系统。C8类同于C18柱，保留能力比C18差。C4，C2，C1反相，用于一些特定的化合物分析，寿命较短。NH2既

32、能用于反相又可用于正相，常用于小分子的糖分析。,色谱柱的保护1、在使用新柱之前，最好用有机溶剂在低流量下（0.2-0.3ml/min）冲洗30min，长时间未用的分析柱也要同样处理。2、定期使用有机溶剂冲洗柱子。3、使用缓冲盐时，要先用含5%-10%甲醇的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗4、净化样品5、分离条件6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干涸,3、柱恒温箱 柱温是液相色谱的重要参数，精确控制柱温可提高保留时间的重现性。一般情况下较高柱温能增加样品在流动相的溶解度，缩短分析时间，通常柱温升高6，组分保留时间减少约30%；升高柱温能增加柱效，提高分离效率；分析高分子化合物或粘度大的样品，柱温必

33、须高于室温；对一些具有生物活性的生物分子分析时柱温应低于室温。液相色谱常用柱温范围一般为室温至60。,四、检测系统,用来连续检测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。,溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应紫外、荧光、电化学检测器,总体检测器：对试样和洗脱液总理化性质响应示差折光，电导检测器,四、检测系统,1、紫外检测器,微量吸收池，光程为2-10mm,体积约为110 L,最小检测量10-9gml-1对流量和温度波动不敏感可用于梯度洗脱。,最常用的通用型检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收优点：灵敏度高 对温度和流速不敏感 可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定有紫外吸

34、收的物质。,四、检测系统,光电二极管阵列检测器,时间、光强度和波长三维谱,二极管阵列检测器的优点采集三维谱图峰纯度检验光谱库检索可以发现单波长检测时未检测到的峰,2、荧光检测器,四、检测系统,灵敏度高选择性好样品量很小适合药物和生化样品分析,原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点：灵敏度高，是最灵敏的检测器之一 选择性好 对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）,3、蒸发光散射检测器,四、检测系统,适于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测,通用型和质量型检测器,原理：流出物在

35、检测器中被高速氮气喷成雾状液滴，溶剂挥发后，溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统，进入散射室中，检测散射光的强度。优点：消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移，可梯度洗脱，灵敏度高，是HPLC的通用型检测器。缺点：不能使用不挥发性盐做流动相，如磷酸盐,溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml 对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗,4、示差折光检测器,四、检测系统,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：对温度变化敏感对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测属于中等灵敏度的检测

36、器,五、数据处理和计算机控制系统,色谱工作站在线显示自动采集处理储存自动控制,第四章 高效液相色谱方法,第一节 HPLC的固定相和流动相 第二节 HPLC方法及原理,1、要求：粒径小、颗粒分布均匀 传质快、渗透压小 机械强度高、能耐高压 化学稳定性好,第一节 HPLC的固定相和流动相,一、固定相,一、固定相,（1）按承受压力分刚性固体：硅胶为基质 主要用于吸附、分配和键合色谱硬 胶：以聚合物为基质 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱,2、固定相载体,（2）按孔隙深度分表面多孔型：实心玻璃珠为基体，基体表面覆盖一层多孔活性材料 适于常规分离分析全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成适于复杂混合物的

37、分离。,一、固定相,2、固定相载体,3.常用固定相液固色谱固定相 常用粒径310m，理论塔板数过 5 万/米 无定形全多孔硅胶：YWG 球形全多孔硅胶：YQG 高分子多孔微球：YSG,一、固定相,3.常用固定相化学键合固定相 以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上,一、固定相,Si-O-R：热不稳定、易水解，适于不含水或醇的流动相Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性较好。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，pH2-8范围内对水稳定,3.常用固定相化学键合固定相,一、固定相,3.常用固定相化学键合固定相非极性键合相：十八烷

38、基键合相（ODS，C18）中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氰基键合相,一、固定相,3.常用固定相其它固定相离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子交换树脂空间排阻色谱固定相：凝胶手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体,一、固定相,二、流动相淋洗液，洗脱剂,对样品有适宜溶解度，k=2 5；溶剂要与检测器匹配。高纯度、化学稳定性好适宜的粘度。过高柱压增加；过低易产生气泡,1、流动相要求,常用的低粘度溶剂：甲醇、乙腈等粘度过低的溶剂：戊烷、乙醚等,2、流动相组成,按组成不同：单组分和多组分；按极性：极性、弱极性、非极性；按使用方式

39、：固定组成淋洗和梯度淋洗。,二元或多元组合溶剂可灵活调节流动相极性,常用溶剂:烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。,二、流动相淋洗液，洗脱剂,正相色谱：极性固定相非极性流动相（加极性调节剂如氯仿）极性柱（正相柱）,三、固定相和流动相的选择,反相色谱：非极性键合固定相（ODS）极性流动相非极性柱（反相柱）,组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,流动相可选水或一定pH缓冲液，加甲醇或乙腈调节极性）,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,HPLC方法,按流动相和固定相特征分为 正相色谱、反相色谱按分离目的分为 分析型、制备型按分离机理分为 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色

40、谱等。,第二节 HPLC方法及原理,一、液-液分配色谱法（LLPC）二、化学键合相色谱法（CBPC）三、液-固吸附色谱法(LSAC)四、离子交换色谱法（IEC）五、尺寸排阻色谱法（SEC）,一、液-液分配色谱法（LLPC）,1.固定相,强极性固定液：，一氧二丙睛中等极性固定液：聚乙二醇非极性固定液：角鲨烷,要求：流动相不与固定相互溶，流动相与固定相极性差别显著避免固定液流失,2.流动相,一、液-液分配色谱法（LLPC）,适于各种极性化合物的分离,4.用途,根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。,3.分离原理,缺点：固定液机械涂渍、固定液易流失,1、反相键合相色谱法（R

41、PBPC）,固定相：采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37（ODS，C18）、硅胶-苯基等,二、化学键合相色谱法（CBPC）,流动相：采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。,分离机理疏溶剂作用理论,非极性的烷基键合相硅胶表面的十八烷基“分子毛”较强的疏水特性。,二、化学键合相色谱法（CBPC）,1、反相键合相色谱法（RPBPC）,分子中非极性部分疏水烷基 缔合作用，分子保留分子极性部分极性流动相 离开固定相，减小保留,两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为,流动相极性溶剂分离物极性官能团有机物,改变流动相配比可分离极性化合物用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离

42、易离解的样品有机酸、有机碱等。,用途,1、反相键合相色谱法（RPBPC）,主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物,二、化学键合相色谱法（CBPC）,固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等）分离机理：范德华力、诱导力或氢键力用途：多用于分离极性或中等极性化合物,2、正相键合相色谱法（NPBPC）,二、化学键合相色谱法（CBPC）,3、离子键合相色谱法,固定相：硅胶为基质，键合各种离子交换基团，如一SO3H、一CH2NH2、C00H流动相：一般采用缓冲溶液。,二、化学键合相色谱法（CBPC）,分离原

43、理：与离子交换色谱类同,用途：多用于分离离子型化合物如酸、无机阴阳离子、氨基酸等,分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同,三、液-固吸附色谱法(LSAC),固定相：吸附活性强弱不等的吸附剂 硅胶、氧化铝、聚酸胶等。,流动相：各种极性的洗脱剂,用途：非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。特别适用于分离异构体,原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别,固定相：基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂,四、离子交换色谱法（IEC）,流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液,用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。,固定

44、相：化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。,流动相：作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。,五、尺寸排阻色谱法（SEC）,常用流动相四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水,原理：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。,凝胶过滤色谱：以水或缓冲液作流动相主要适合于水溶性高分子的分离凝胶渗透色谱：以有机溶剂作流动相主要适合于脂溶性高分子的分离,用途,五、尺寸排阻色谱法（SEC）,特点：固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长相对分子质量差别必须大于10才能分离,第五章 HPLC的建立与应用,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,1、根据被分析样品

45、的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。,材料来源、浓度范围组分特性、结构、分子量、溶解性等,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,2、选择合适的分析方法适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）流动相检测器样品预处理,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,3.分析条件的优化,流动相种类与配比梯度温度流速检测波长进样量,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。,二、HPLC定性定量分析方法,1、定性分析,（1）色谱鉴定法：保留时间对照 各物质在一定色谱条件下均有确定不变的保留时间，因此保留时间可

46、作为定性指标。,应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点：应用简便，不需要其它仪器。缺点：定性结果的可信度不高。,（2）与其他仪器或化学方法联合定性混合物经色谱分析后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：LC-FTIR、LC-MS等其它仪器相当于色谱仪的检测器。使用范围：复杂样品的定性。优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。缺点：需要特殊仪器或设备。,二、HPLC定性定量分析方法,2、定量分析,（1）色谱定量基础色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。（2）定量要解决的问题峰面积的测量和计算色谱定量方法及其应用,峰面积的测量和

47、计算积分仪或色谱工作站简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。手动测量与计算,定量方法面积归一化法内标法外标法,面积归一化法应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应，各组分峰没有重叠时，可用此法。优点：简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。缺点：对该法的苛刻要求限制了它的使用。,内标法将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。优点：受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象归一化法那样受限制，此

48、法适合于微量物质的分析。缺点：每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。,外标法（标准曲线法）用于常规分析优点：操作简单，计算方便。缺点：结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。,1、在食品分析中的应用食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等；食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等；食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。2、在环境分析中的应用 多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。,三、HPLC的应用,3、在生命科学中的应用 分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具低分子

49、量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定,三、HPLC的应用,4、在医学检验中的应用 体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等5、在无机分析中的应用 阳、阴离子的分析等。,三、HPLC的应用,我国药典收载HPLC法项目和数量比较表,2010版药典二部中色谱柱的使用情况,注意事项,1、流动相的配制 所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。先抽滤、后超声（10-15分钟

50、）。2、测定法要求 样品进样前先混匀，再用0.45m滤膜过滤，再混匀后进样。对照品与样品进样量要尽量保持一致。平行进针要求RSD2。进样针每次改进不同样品或对照品时，需用色谱甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超过进样量位置。,注意事项,3、仪器使用过程中注意事项 注意机器异常情况的发生（声音），压力是否过高（超过200Bar不可再做实验），流动相是否流空、废液瓶是否已满等等。4、实验完毕后 用甲醇冲洗一小时，如果流动相中含有酸或缓冲盐，则先用新鲜纯水：甲醇=90：10的流动相冲洗0.5小时，再用甲醇冲洗一小时。,注意事项,5、人参、西洋参等含量测定 做波长小于240nm的样品时，注意机器、柱子一定要