代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建.docx

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1、眉题2 代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建立张娅玲1,2, 白艳秋1,21 中国科学院北京基因组研究所, 北京 1013002 中国科学院研究生院, 北京 100039摘要: 为发现代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)的调节剂, 通过荧光检测胞内钙浓度的方法, 建立一个基于细胞功能性检测的高通量筛选(HTS)系统。将人mGluR4基因转染稳定表达Ga15蛋白的人胚肾细胞(HEK-293), 用Zeocin筛选获得稳定表达mGluR4的细胞株, 并通过钙流检测试验证实该细胞系的生物学功能。优化了实验系统中荧光染料的孵育时间, 溶剂二甲基亚砜(DMSO)耐受性, 以及

2、溶剂氢氧化钠(NaOH)耐受性, 建立了可靠稳定的筛选系统。钙流检测试验数据表明, mGluR4细胞系对其激动剂的活性程度排序是: L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyric acid (L-AP4) L-Serine-O-phosphate (L-SOP)L-Glutamic acid (L-Glu); 拮抗剂是: (RS)-a-Methylserine-O-phosphate (MSOP) (RS)-a-Methyl-4-phosphonophenylglycine (MPPG)。在96和384细胞微孔培养板中, 得到该筛选系统Z因子分别是0.80和0.65。结果表明

3、, 该稳定细胞系拥有一个稳定的检测系统, 适合于mGluR4激动剂/拮抗剂的筛选。关键词: 代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4), 高通量筛选(HTS), Ga15, 激动剂/拮抗剂Development of a functional cell-based HTS assay for theidentification mGluR4 modulatorsYaling Zhang1,2, and Yanqiu Bai1,21 Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 101300, China2 G

4、raduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, ChinaAbstract: To identify metabotropic glutamate receptor 4 (mGluR4) modulators by Ca2+ influx assay, we developed the functional cell-based high throughput-screening (HTS) assay. The human mGluR4 cDNA was transfected into HEK-2

5、93 stably expressing promiscuous G-protein (Ga15) cells. Recombinant stable mGluR4 cell line was selected under Zeocin and validated by Ca2+ influx assay. The assay was optimized on loading time of Fluo Calcium Indicator, Dimethyl sulfoxide (DMSO) tolerance and sodium hydroxide (NaOH) tolerance usin

6、g agonist (L-Glutamic acid (L-Glu) of mGluR4. The rank order of the agonist potency for the stable human mGluR4 cell line was L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyric acid (L-AP4)L-Serine-O-phosphate (L-SOP)L-Glu, and of the antagonist potency was (RS)-a-Methylserine-O-phosphate (MSOP)(RS)-a-Methyl-4-phosph

7、onophenylglycine (MPPG). Z factor value of the cell line in 96- and 384-well plate format was 0.80 and 0.65. Our data indicate a successful development of functional human mGluR4 recombinant stable cell line that was suitable for high throughput screening to identify mGluR4 agonist/antagonist.Keywor

8、ds: metabotropic glutamate receptor 4 (mGluR4), high throughput screening (HTS), Ga15, agonist/antagonistJ张娅玲等: 代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建立465谷氨酸是公认的最重要的兴奋性神经递质之一, 其在众多的中枢神经功能方面发挥着重要的作用, 例如: 记忆的获取与学习, 癫痫、中风等功能紊乱, 神经退行性疾病等1。L-谷氨酸通过与谷氨酸受体相结合发挥其生理作用2,3。谷氨酸受体分为2类: 离子型谷氨酸受体(Ionotropic receptors)和代谢型谷

9、氨酸受体(Metabotropic receptors)。离子型谷氨酸受体(iGluRs)包括3个亚型: IV_甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)、红藻氨酸(Kainic acid)和使君子氨酸受体(-amino-3-hydroxy- 5methyl-4. isoxazole propionate, AMPA), 该类受体被激活后能促使离子通道开放, 从而阳离子如Na+、Ca2+等进入细胞内; 代谢型谷氨酸受体(mGluRs)包括mGluR 1-8共8个受体亚型, 为G蛋白偶联受体家族成员4, 有7个跨膜结构, 通过介导第二信使来调节受体生理功能5。根据

10、代谢型谷氨酸受体氨基酸系列同源性、信号转导机制和药理学特性, 将其分为3组: 第1组包括mGluR1和mGluR5, 能被3,5-DHPG选择性的激活, 它们被激活后, 使PLC活化, 促使PI水解产生IP3和DAG, 增强iGluRs异常介导的神经兴奋毒性; 第2组包括mGluR2和mGluR3, 其在重组系统中负调控腺苷酸环化酶(AC), LY379268是其选择性的激动剂; 第3组由mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8组成, 其同样是负调控AC, 可以被L-AP4激活4,5。这些受体被激活后, 可以调节谷氨酸神经递质的传递。神经递质传递的异常将会引起众多的疾病。因此,

11、这些受体已经成为药物研发的重要靶点, 开发与此类受体特异性作用的药物刻不容缓, 而建立快速、方便、经济的筛选平台可以大大加快此类新药的筛选与开发。代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)集中分布于小脑颗粒细胞中, 在嗅觉组织中也发现mGluR4特异性的表达5。发现并开发mGluR4特异性的调节剂, 可以促进众多的与其相关的疾病治疗。大规模的药物开发必不可少的要应用高通量筛选(High throughput screening, HTS)平台, 这样不仅可以节省人力、物力, 又可以大大缩短药物研发前期所消耗的时间。先前的研究报道已有基于细胞水平的功能性检测方法用于筛选mGluR4调节剂6-10,

12、例如: Gomeza J等用鼠mGluR4基因和G-蛋白(Ga15、Ga16、Gaq/I)瞬时共转染人胚肾细胞(HEK-293)后用于mGluR4的研究10; Kowal D等用人mGluR4基因和Gqi稳定共转染仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)并用于mGluR4的相关研究7。在本研究中, 用人mGluR4重组质粒(Human mGluR4-pcDNA4/TO)转染稳定表达Ga15的HEK-293细胞株, 通过抗生素的筛选得到重组细胞株, 并应用钙流检测试验进行进一步的确定及试验条件的优化。结果表明, 一个基于重组细胞水平的功能性检测、适用于鉴定mGluR4激动剂/拮抗剂的HTS平台被成功建立。1

13、材料和方法1.1 试剂和仪器稳定表达Ga15的人胚肾细胞(HEK-293/Ga15)由本实验室保存; DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium powder, high glucose, Gibco BRL); Glutamine-free DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, high glucose, 1X, -L-Glutamine, Gibco); FBS (Fetal Bovine Serum, Hyclone); dFBS (Dialyzed Fetal Bovine Serum, Hyclone); 选择

14、性抗生素Zeocin (Invitrogen); Trypsin (Invitrogen); MatriGel Matrix (BD Bioscience); 转染试剂LipofectamineTM2000 (Invitrogen); 荧光染料Fluo-3/AM (Molecular Probes); Probenecid (Sigma); L-Glutamic acid (L-Glu, Sigma); L-AP4 (L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyric acid), L-SOP (L-Serine-O-phosphate), MPPG (RS)- a- Methy

15、l-4-phosphonophenylglycine)和MSOP (RS)-a- Methylserine-O-phosphate)从Tocris购买。1.2 质粒构建通过基因合成获得人源mGluR4的cDNA, 并且通过Not I + Xba I亚克隆到真核生物表达载体pcDNA4/To上。所得到的表达质粒命名为mGluR4- pcDNA4/To.1.3 稳定表达mGluR4细胞系构建稳定表达Ga15蛋白的人胚肾细胞(HEK-293/ Ga15)培养在含有10% FBS的DMEM培养基中, 置于37oC, 5% CO2温箱中培养。将HEK-293/Ga15接种于6孔细胞培养板中, 待细胞生长

16、到50%70%汇合率时用于转染。使用LipofectamineTM2000将人源mGluR4-pcDNA4/TO质粒转染HEK-293/Ga15细胞(转染操作参照试剂盒说明书进行), HEK-293/Ga15细胞作为阴性对照。转染24 h之后, 将细胞以1:5和1:10的比例传代于100 mm培养皿中。细胞贴壁生长24 h之后, 加入120 mg/mL Zeocin进行抗生素筛选。每3 d换一次加有120 mg/mL Zeocin的新鲜培养基, 连续筛选2周。当阴性对照细胞(没有转染的HEK-293/Ga15)在抗生素作用下完全死亡之后, 挑选单细胞克隆团于96孔细胞培养板中(Corning

17、costar)进行扩大培养。根据激动剂作用于细胞后引起胞内钙流变化的原理进行阳性细胞克隆的选择。选择具有明显钙流信号变化的细胞克隆(设定为P0代)传代培养, 并进行进一步的功能验证。当细胞生长到90%汇合率的时候即进行传代培养, 以1:8到1:10的比例传代培养于含有5 mL新鲜培养基(加有60 mg/mL Zeocin)的60 mm细胞培养皿中。1.4 钙流检测试验方法钙流检测方法是通过使用仪器FlexStation (Molecular devices)检测荧光染料Fluo-3/AM标记的钙流变化, 在FlexStation荧光成像分析系统中, 激发波长为485 nm, 发射波长为525

18、nm。细胞以2 104 /well的密度接种于MatriGel Matrix预先包被的96孔黑壁透明底板中(Cloning costar), 过夜培养于37oC、5% CO2温箱。第2天, 小心吸弃孔中全部培养基, 每孔细胞加入100 mL含有5% dFBS的glutamine-free DMEM, 在37oC、5% CO2温箱培养1224 h。进行钙流检测试验时, 小心吸弃细胞培养基, 每孔细胞中加入100 mL含有1 mmol/L Probenecid, 1Quencher和4 mmol/L Fluo-3/AM的1HBSS buffer (1.26 mmol/L CaCl2, 0.49 m

19、mol/L MgCl2, 0.41 mmol/L MgSO4, 5.33 mmol/L KCl, 0.44 mmol/L KH2PO4, 137.93 mmol/L NaCl, 0.34 mmol/L Na2HPO4, 5.56 mmol/L D-Glucose, 20 mmol/L HEPES, 4.17 mmol/L NaHCO3, pH 7.4), 将细胞置于37oC避光孵育90 min。激动剂(L-Glu, L-AP4或L-SOP)配制成5测试浓度, 以25 mL/s的速度将25 mL的化合物加入到细胞中, 在加入化合物16 s之后采集钙流数据直至120 s以上。检测拮抗剂活性时, 将

21、粒(mGluR4-pcDNA4/TO)转染稳定表达Ga15的HEK-293细胞株, 通过抗生素的筛选共得到68个重组细胞株。用500 mmol/L L- Glu激活mGluR4, 从而引发内钙动员, 进而检测钙信号。其中, 检测到32个克隆有明显的钙信号, 但母细胞系HEK-293/Ga15胞内钙离子水平没有变化。最终挑选了1个信号较强的克隆作为待定细胞株, 命名为mGluR4/HEK-293/Ga15, 进行扩大及传代培养, 进一步考察其特异性及稳定性, 同时优化其用于HTS时的筛选条件。2.2 筛选条件的优化某检测方法是否适用于HTS, 具有严格的评判标准, 例如: 好的信躁比值, 高灵敏

22、度以及一致性11。为了评估在检测系统中产生的信号的动力学效应, 诸如荧光染料的孵育时间, 溶剂DMSO和NaOH的耐受性等钙流检测参数都被做了优化。钙荧光染料(Fluo-3/AM)的孵育时间是影响钙流检测系统信躁比值的因素之一。为了在mGluR4/ HEK-293/Ga15细胞株得到高的信躁比, 本研究首先优化了钙荧光染料的孵育时间。钙荧光染料孵育时间越长, 就能得到越高的钙流信号(数据没有显示)。在以下的试验当中, 钙荧光染料的时间被选定为90 min。为了评估由通用溶剂DMSO和NaOH引起的非特异性本底, DMSO 和NaOH耐受性通过钙流检测试验被测定。试验结果表明, 当DMSO和N

23、aOH终浓度分别达到0.5% (图1A)和0.2% (图1B)时, 对于在mGluR4/HEK-293/Ga15细胞株上进行钙流检测试验没有显著的影响。因此, 在后续试验中, DMSO和NaOH的终浓度分别被选定为0.5%和0.2%。图1 DMSO (A)和NaOH (B)耐受性检测Fig. 1 DMSO (A) and NaOH (B) tolerance detection. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader.2.3 mGluR4/HEK-293/Ga15细胞株功能性

24、检测在以上优化后的实验条件下, 分别用不同浓度的mGluR4激动剂 (L-Glu、L-AP4和 L-SOP) 和拮抗剂(MSOP和 MPPG) 作用于mGluR4/HEK-293/ Ga15细胞株, 检测细胞内钙离子浓度的变化, 以证实mGluR4筛选模型的功能活性。首先, 通过胞内钙流检测试验, 得到3种激动剂(L-Glu、L-AP4和 L-SOP)的剂量依赖效应曲线。结果表明, 这3个激动剂的半数有效刺激浓度(EC50)均与文献报道相符(表1)。L-AP4是最强的激动剂, 其EC50为0.27 mmol/L(图2); L-SOP和L-Glu次之, EC50分别为2.85 mmol/L和12

25、.04 mmol/L(图2)。图2 激动剂对mGluR4细胞的剂量效应Fig. 2 Dose response of agonist on mGluR4 cell line. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. Data points represent means SEM. EC50 value was determined using GraphPad Prism 5 software.另外, 通过钙流检测方法, 本研究测试了2个拮抗剂MSOP和 MPPG。用10 m

26、mol/L的刺激剂L-Glu刺激细胞内钙的释放, 同时用不同浓度的拮抗剂抑制此胞内钙的释放, 从而得到拮抗剂的剂量依赖曲线(图3), 并与文献报道相符(表1)。MSOP和MPPG的半数有效抑制浓度(IC50)分别是 32.83 mmol/L和59.90 mmol/L (图3)。2.4 mGluR4/HEK-293/Ga15细胞株稳定性考察众所周知, 有效性、特异性、可溶解性、稳定性、毒性以及化合物和靶体之间的作用机制对于基于细胞水平的检测方法至关重要。一旦靶体选定, 稳定表达该靶体的细胞系就要被构建并且在传代培养时不被丢失。为了考察该mGluR4/HEK-293/Ga15细胞株的稳定性, mG

27、luR4/HEK-293/Ga15细胞在 60 mg/mL Zeocin的条件下培养至20代以上, 冻存 1代、5代、10代和20代细胞。之后同时检测L-Glu或MSOP在这几代的mGluR4细胞上的作用。如图4所示, 激动剂L-Glu的EC50 (图4A, 3.51 mmol/L 8.82 mmol/L)和拮抗剂MSOP的IC50 (图4B, 19.30 mmol/L37.19 mmol/L)在不同代数细胞之间基本保持一致(表2)。由此可见, 该mGluR4/HEK-293/ Ga15细胞株是稳定的。表1 mGluR4激动剂和拮抗剂作用活性总结(单位: mmol/L)Table 1 Pote

28、ncy of agonist and antagonist of mGluR4 (mmol/L)CategoryCompound nameReportedOur dataReferenceEC50IC50EC50IC50AgonistL-Glu538/12.04/12, 13, 14, 15L-AP40.3/0.27/16L-SOP2.7/2.85/8, 12, 13, 16, 17AntagonistMSOP/11.44/32.8318MPPG/110/59.9013图3 拮抗剂对mGluR4细胞的剂量效应Fig. 3 Dose response of antagonist on mGluR

29、4 cell line. Agonist L-Glu (10 mmol/L) was used to induce a calcium influx. For MPPG, final concentration of NaOH is 0.2%. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. Data points represent means SEM. IC50 value was determined using GraphPad Prism 5 software.表2 mGl

30、uR4激动剂L-Glu和拮抗剂MSOP作用于不同代细胞之间的活性总结(单位: mmol/L)Table 2 Potency of L-Glu and MSOP at different passages of cells (mmol/L)PotencyP1P5P10P20L-GluEC503.515.454.578.82MSOPIC5037.1928.6719.3024.182.5 Z因子评估高质量的检测系统以及强有力的数据分析为鉴定真正有活性的化合物提供了保证。Z因子是一种被大众所广泛接受的既简便又实用的检测系统评价参数19,20。Z因子的大小介于和1之间。当0.5Z1时, 意味着此检测系

31、统是一个有效的系统; 当0Z0.5时, 意味着此检测系统基本可行; 当Z=0时, 意味着此检测系统模棱两可; 当Z0时, 意味着此检测系统根本不可行20。在本次试验当中, 图4 mGluR4细胞株稳定性检测Fig. 4 Stability of mGluR4 cell line. Dose response curves of agonist-L-Glu (A) and antagonist-MSOP (B) for passages 1, 5, 10 and 20 were showed. Agonist L-Glu (10 mmol/L) was used to induce a calc

32、ium influx. The cell was tested up to passage 20. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. Data points represent means SEM. EC50 and IC50 value were determined using GraphPad Prism 5 software.图5 Z因子检测Fig. 5 Z factor determination. mGluR4/HEK-293/Ga15 cell line

33、was stimulated with 100 mmol/L L-Glu (positive) and assay buffer (negative). Assays were monitored with FlexStation plate reader. (A) 96-well plate format. (B) 384-well plate format.不仅检测了用96-孔板进行钙流检测试验时的Z因子(图5A), 同时也用384-孔板进行了检测(图5B)。用300 mmol/L的L-Glu刺激mGluR4并引发钙动员, 用缓冲液作用于该细胞系以得到试验背景, 之后所得到的Z因子分别为0

34、.80和0.65, 由此说明该mGluR4检测系统适用于HTS。2.6 模拟筛选进行HTS时, 成千上万的化合物都会用数块96或384-孔板进行HTS筛选。本研究模拟了在96-孔板上的筛选过程。用上述建立好的mGluR4钙流检测方法筛选74种已知化合物(包括小分子化合物及具有活性的多肽)。化合物用DMSO进行配制, 其终浓度是10 mmol/L, DMSO终浓度是0.5%, 以满足HTS的要求。模拟筛选结果显示, 在该96-孔板不同位置所设置的阳性对照(300、100、30和10 mmol/L L-Glu)及阴性对照(缓冲液)都检测到了相应的钙信号(图6)。从中也得到了一些对于该mGluR4有

35、活性的化合物。总之, 该模拟筛选结果显示, mGluR4检测方法适用于HTS以鉴定mGluR4的活性化合物。图6 模拟筛选Fig. 6 Spiking test. The test was performed and monitored with FlexStation II plate reader. Scatter plot of spiking data test of the positive control and compound were showed. Positive: 300 mmol/L L-Glu; Negative: assay buffer with 0.5% DM

36、SO.3 讨论mGluR4是结合于Gi类的G蛋白, 目前对Gi偶联的G蛋白偶联受体可以通过同位素结合试验, cAMP定量试验、报告基因系统、荧光检测钙流等方法进行检测。与其他检测方法相比, 通过荧光检测胞内钙水平变化的方法来筛选GPCR的激动剂/拮抗剂灵敏度高、耗时短、使用范围更广泛、操作更简便。在本研究中, 选择HEK-293/Ga15作为表达人源mGluR4的母细胞。这是因为HEK-293细胞已经被证明非常适合于异源表达GPCRs, HEK-293细胞容易生长形成单层细胞, 具有很强的生长活性和较强的贴壁能力。更重要的是, Gi类的G蛋白不能引起细胞内的钙流变化; 而HEK-293/Ga1

37、5细胞中的Ga15可以将mGluR4偶联到PLC通路上, 继而可以通过检测钙流的变化来间接反应mGluR4的作用。由图2可以看出, 在激动剂L-AP4的作用下, mGluR4/HEK-293/Ga15细胞产生了内部钙流变化, 并且呈剂量依赖关系, EC50大约为0.27 mmol/L, 而母细胞HEK-293/Ga15却没有类似明显的胞内钙流的变化。通过人源mGluR4质粒转染HEK-293/Ga15细胞, 建立了人源mGluR4稳定表达的细胞系。首先, 使用激动剂L-Glu对mGluR4/HEK-293/Ga15钙流检测试验时的一些系统检测因子, 包括钙荧光染料的孵育时间, DMSO耐受性和

38、NaOH耐受性进行了优化。其次, 使用mGluR4特异性的激动剂/拮抗剂对mGluR4/HEK-293/Ga15进行了验证。结果显示, 这个重组细胞系适用于发现mGluR4的激动剂/拮抗剂。更重要的是, 本研究对该检测系统进行了统计学意义上的评估。在96及384-孔板上所得到的Z因子均大于0.5, 这强有力地证明mGluR4细胞系适用于HTS。最后, 74个化合物在96-孔板上通过模拟筛选, 所有的阳性及阴性对照都得到了肯定的结果, 这些说明该mGluR4检测系统可以非常灵敏的用于HTS, 从而鉴定mGluR4活性化合物。综上所述, 本研究第一次用HEK-293/Ga15母细胞建立了一个稳定高

39、表达人源mGluR4的重组细胞系: mGluR4/HEK-293/Ga15。这个细胞系不仅适用于细胞功能性研究, 而且适用于结合试验中的膜蛋白的提取, 增强了配体特异性的结合。本研究所建立的mGluR4的重组细胞系是一个灵活的、稳定的、有效的、适用于HTS体系, 可以用于药理学分析、功能性研究以及筛选mGluR4的激动剂/拮抗剂。REFERENCES1 Tanabe Y, Masu M, Ishii T, et al. A family of metabotropic glutamate receptors. Neuron, 1992, 8: 169-179.2 Yang ZQ. Agonis

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