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1、中药生物指纹图谱调研报告一、中药生物指纹图谱简介中药生物指纹图谱（biological fingerprint of TCM）是利用基因组学和蛋白组学技术研究药材基因型特征和中药作用于特定生物细胞后引起基因和蛋白的表达的变化规律和作用机制，从分子水平上揭示中药、中药与生物的细胞作用后的基因与蛋白的表达特征，研究解决化学成分和药理作用、药效活性的相关性，是中药指纹图谱研究的一个重要方面和最高级阶段。主要包括中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱 和中药材 DNA 指纹图谱1。目前，由于宏观上中药作用靶点和作用机制的多样性及对基因作用的多样性，中药基因组学指纹图谱和蛋白质组学指纹图谱可反映中药
2、制剂作用于某特定细胞或动物后所引起的基因或蛋白的特定构象的复杂变化情况。这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。这种指纹图谱不但包含了化学信息，也体现了和此相关的药效、临床疗效等生物医药信息，通过比较不同蛋白质、基因指纹图谱体现的不同药效结果，就可确定何种物质基础 (化学成分群 )是该中药制剂的最佳方式，而且为解决中药研究中缺乏标准品的难题提供了一条可行之路1。目前，中药基因组学和蛋白质组学有关指纹图谱的研究工作正在开展。中药蛋白质组学及基因组学指纹图谱可从分子水平上丰富整个中药指纹图谱研究体系。无论是中成药二次开发，还是中药新药研究，都有一个关键问题需要解决-逐步在分子水平上研究解决化学成分(
3、物质基础)和药理作用、药效活性的相关性。而其中，通过蛋白质组学的研究得到的蛋白质组学指纹图谱又具有很高的说服力。中药材 DNA指纹图谱多运用聚合酶链反应 ( PCR) 从不同生物样品中人工合成 DNA 片段, 这种 DNA片段的大小、数目因不同生物而异, 因而称之为 DNA 指纹图谱。由于 DNA分子标记技术直接分析的是生物遗传因子而非表现型, 所以结果可不受环境因素、 样品状态和材料来源等外界条件的影响, 因此为中药品种鉴别中极为可靠的手段。随着分子生物学技术的发展, 已有文献报道用 DNA指纹图谱作为药材的鉴定方法.李晓波2等人的研究预示 DNA 指纹技术正在逐渐成为中药鉴定的一种新方法。
4、DNA 指纹图谱由于其特点，无法客观反映药用植物因外部环境影响基因表达造成的药效成分含量的差异，只能用于药材种质资源的考察。对于 DNA 指纹技术在中药材鉴定方面的推广和普及的关健是降低检测成本和简化操作过程。目前，应用于中药质量研究的 DNA分析技术主要有分子杂交和 PCR 两方面。前者有以低拷贝序列基因为对象的RFLP(限制性内切酶片段长度多态性 ),以中度重复序列为对象的卫星 DNA 指纹图，后者有 RAPD (随机扩增 多态性DNA)，AFLP(扩增片断长度多态性 )和 DNA 测序等 。二、中药生物指纹图谱应用中药谱效关系研究弥补了目前以化学指纹图谱控制中药质量时与药效脱钩的不足，可
5、为中药质量控制提供更为科学有效的数据。但是中药谱效关系研究需要制备足够量的样品开展药理实验，因此不适于中药复杂体系效应成分的高通量筛选与确证。为此，高通量筛选中药效应成分的生物指纹图谱技术的出现为中药有效性评价提供了另一思路和方法。生物色谱法是应用最早的生物指纹图谱技术，包括分子生物色谱、生物膜色谱和细胞生物色谱等，其基本原理是将生物大分子或靶体甚至细胞 (酶、受体、DNA、仿生物膜、细胞等)固着于色谱担体上，作为一种生物活性填料用于液相色谱，形成一种能够模拟药物与生物大分子、 靶体或细胞相互作用的色谱系统，这样就可以利用色谱参数快速、精确、稳定地表征药物与生物大分子靶体或细胞间的相互作用。由
6、于能与生物体系发生相互作用是化学成分发挥药效的前提，因此可借此从复杂的中药化学成分中筛选潜在的效应成分(组)。例如，孔亮等3根据不同药物与人血清白蛋白( HSA)结合力的差异，应用HSA分子生物色谱分析中药活性成分。在相同的色谱条件下，用 HSA柱分别分离了当归、黄芪、川芎和赤芍四种单味中药的水提物，发现它们的分离情况各有特征。当归、黄芪谱图中各有 4个明显的保留组分，赤芍谱图中有 2 个保留组分。与HPLC相比，HSA分子生物色谱排除了大量非作用成分的干扰，同时，与 HSA的相互作用可表征化学成分在体内的分布、代谢及排泄等过程。为此，HSA分子生物色谱法可用于筛选中药中可能的生物活性成分。目
7、前，对中药生物指纹图谱的研究开展较少，较成熟的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 同工酶法和随机扩增多态 DNA技术（RAPD ）等方法。石俊英等4在国内首先将PAGE法应用于植物、动物类中药材的真伪鉴别。DNA指纹图谱技术比传统的四大鉴别方法更为准确、客观，适用范围更广，非常适合于近缘种、易混淆品种、珍稀品种、动物药材、破碎药材、陈旧药材、腐烂药材及样品量极为有限的植物模式标本、中药出土标本、古化石标本等珍贵样品的鉴定5。它不仅能区分相近物种(同科、同属不同种) ，而且可以检测外型极为相似的同种中不同变种、变型、品系、乃至个体之间的DNA的细微变异。这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药
8、材鉴别，道地药材的鉴定以及动、植物中药种质资源和遗传育种的研究中,并且取得了令人瞩目的成果。Mizukami比较分析了当归Angelica acutiloba ( Sieb. etZucc. ) Kitag. 、三岛柴胡B upleurum falcatum acut. sin. non L. 和珊瑚菜Glehnia littoralis Fr. Schmidt exMiq. 的5S rRNA基因的间隔区的碱基序列，针对该DNA 片断的序列差异，选用限制性内切酶Hind消化PCR产物，所获得的图谱可鉴别此3种药材6。王建云等从鸡内金类药材中提取DNA，采用cyt2b基因PCR 特异扩增,DNA
9、测序得到约143个碱基的序列片断，其中36个碱基的差异可以明确区分外观十分相似的鸡内金与鸭内金7。王义权等在蛇类药材的cytb基因片断序列分析基础上，设计了金钱白花蛇PCR 鉴别的一对高特异性引物BuL-和BuH-，用此引物能在药材粉末中检测出被检样品中是否含有金钱白花蛇8。Hashimoto等9用PCR 方法扩增了鹿茸、蝮蛇和海马的12S rRNA 和cytb基因片断，并对鹿茸的PCR产物进行了测序，经电泳检测可达到鉴别的目的，同时还建立了制剂中鹿茸的检测方法。中药材真伪鉴别及品种鉴定是目前DNA指纹图谱技术在中药研究中应用最多的一个领域。目前药材市场上还大量存在不同替代品混用的现象，不同地
10、区同名异物入药，或是紧俏药材使用其近缘植物入药，甚至使用其它伪品假冒名贵药材。尽管药材在干燥过程中DNA有所降解，但干品仍然带有足够多的DNA信息特别是稳定的小分子带，可供鉴别药材使用10，因此，不论新鲜药材还是干品饮片，或是不同药用部位，通过DNA指纹图谱技术皆能准确予以鉴别。近年来这方面的研究较多，如人参、西洋参的鉴别11，西洋参及其伪品的鉴别12，人参不同栽培品种鉴定一三，山参、园参与西洋参指纹图鉴别14，厚朴及其伪品的鉴别一五，大黄正伪品的鉴别16，不同产地牛蒡子DNA指纹图谱鉴别17，金银花品种鉴定一八。中药材的质量除了与药材特定的生长环境和特殊的采收加工技术有关外，还与该药材产区内
11、这一物种的地方种群或居群中遗传上的特殊性有关，这就是药材的“道地性”。但以前对道地药材“道地性”的研究仅限于化学、药理学方面。通过DNA分子手段和化学、药理学手段结合对道地药材进行研究，并进一步对遗传因素和环境因素在药用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的关系进行研究，能更好地对道地药材、名优药材进行品质评价，这对指导道地药材的科学栽培、饲养和药用优良品种的选育具有重要意义。李萍等19用SDS法提取金银花（FlosLonicera japonica）不同居群、外类群细毡毛忍冬（Lsimitis）和山银花（Lconfusa）的总DNA，进行5S-rRNA基因间区的PCR扩增和测序，并用软件Me
12、ga进行分析。结果显示，Lonicera L属植物5S-rRNA基因间区约210 bp，其中G+C含量较高，达70%左右；不同居群的L.japonica碱基序列有差别，通过测序可以进行鉴别。Lconfusa与Ljaponica间的遗传距离较大。种间5S-rRNA基因间区的序列差异大于种内；道地药材之间的遗传距离较小；道地与非道地药材之间的遗传距离大于道地药材之间的遗传距离。可见通过对道地药材DNA指纹的认定，还可提供划分药材档次的分子标记。三、结语化学指纹图谱反映中药的质量优劣，而生物指纹图谱反映中药的品种真伪。从中药的遗传物质到化学活性成分的系列研究，以生物遗传数据库、化学成分数据库为基础，
13、运用数学方法建立多元统计模型，可体现出中药生物信息与化学信息的复杂关联，创立全新的中药鉴别和质量评价体系。从中药新药研究出发，可在开始研究阶段，即同时进行化学成分指纹图谱和生物指纹图谱的研究，一举达到建立同时体现化学和分子生物指纹图谱。这样，中药新药开发研究乃至整个中医药理论将会增添更多的方法和内容，实现中医药理论质的飞跃。参考文献1 王志平, 乔建军, 元英进. 蛋白质组学在中药现代化研究中的应用 J . 中草药, 2004, 35 (1) : 1-4.2 李晓波, 壬峥涛, 徐路珊. 中药的DNA 分子鉴别研究 C . 中国药学会学术年会论文集(上册), 2001: 209- 11.3 K
14、ong L, Zou H F, Wang H L, e t a.l Chem ica Research in Ch ineseU niversities (孔亮, 邹汉法, 汪海林, 等. 高等学校化学学报), 2000, 21 ( 1): 36.4 石俊英，于燕莉，卢燕.RAPD和POD分析技术在金银花品种鉴定中的应用J.山东中医药大学学报，2001，25（2）：一三7-一三8.5 徐红,王峥涛,胡之壁. 中药DNA分子鉴定技术的发展与应用 J . 世界科学技术中医药现代化技术, 2003(2) : 24 - 31.6 Mizukami H. Amp lification and seque
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