标记抗体技术医学课件.ppt

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1、标记抗体技术,1,编辑版ppt,标记抗体技术1编辑版ppt,抗原与抗体能特异性结合，但抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。有一些物质即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检测出，如果将这些物质标记在抗体分子上，可以通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在，根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术(labeled antibody technique)。,2,编辑版ppt,抗原与抗体能特异性结合，但抗体、抗原分子小，,高敏感性的标记分子主要有荧光素、酶、放射性同位素3种，由此建立免疫荧光抗体技术、免疫酶标记技术和放射免疫分析。其特异性和敏感性

2、远远超过常规血清学方法，被广泛应用于病原微生物鉴定、传染病的诊断、分子生物学中的基因表达产物分析等各个领域。,3,编辑版ppt,3编辑版ppt,荧光素和荧光酶 发光器官主要靠两种物质产生光，一种叫荧光素，另一种叫荧光酶。当荧光素被一定波长的光激发时就会产生光，而荧光酶则是一种催化剂，它能帮助荧光素与氧结合产生氧化反应，同时产生光。深海动物发出的光是一种不发热的“冷光”，由于发光动物含有的荧光素和荧光酶不同，因此发出的光的颜色也不同，主要有橙、红、黄、绿、蓝、紫、白等颜色，但以蓝绿色光居多。,4,编辑版ppt,荧光素和荧光酶 发光器官主要靠两种物质产生光，一种,荧光素和荧光酶 大多数发光生物是通

3、过自己身体内的荧光素和荧光酶产生光，而少数发光生物则是依靠寄生在其发光器内的发光性细菌发光，例如有一种闪光鱼，在其发光器内寄生着上百亿个发光细菌。有些水母只能通过吃掉其他发光动物才能发光。,5,编辑版ppt,荧光素和荧光酶 大多数发光生物是通过自己身体内的荧,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。,四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595600nm，呈现橘红色荧光。,

4、常见的荧光素,6,编辑版ppt,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocya,四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate,TRITC)TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。,常见的荧光素,7,编辑版ppt,四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodami,藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，红色荧光。,

5、酶作用后产生荧光的物质:某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。辣根过氧化物酶。蓝色,常见的荧光素,8,编辑版ppt,藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红,碘化丙啶（propidiumiodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。红色荧光,多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyllprotein，PerCP）：PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物。深红色,常见的荧光素,9,编辑版ppt,碘化丙啶（propidiumiodide，PI）：可选择性,生物学、化学和细胞学实验的特

6、殊试剂：藻蓝蛋白还是一种十分稀有的色素蛋白，具有荧光特性，当受光激发，可发出强烈的红色荧光，用于肿瘤和癌症的临床体外诊断上，对细胞的早期癌变诊断意义重大，可作为一种新型的光敏剂。,藻蓝蛋白,藻红蛋白,10,编辑版ppt,生物学、化学和细胞学实验的特殊试剂：藻蓝蛋白还是一种十分稀有,流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,它们分子结构不同，激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488m,氦氖离子气体激光管发射光波长633m）。488m激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）

7、、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。,11,编辑版ppt,流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,它们分子结构不同，激发,它们的激发光和发射光波长分别是：染料名激发光波长（m）发射光峰值（m）FITC 488 525（绿）PE 488 575（橙红）PI 488 630（橙红）ECD 488 610（红）CY5 488 675（深红）PreCP 488 675（深红）,12,编辑版ppt,它们的激发光和发射光波长分别是：染料名激发光波长（,合适荧光素的选择：（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。（2）荧光效率高，标记后下降不明显。（3）荧光色泽与背景色

8、泽对比鲜明。（4）标记后能保持生物学活性和免疫活性。（5）标记方法简单、快速。（6）安全无毒。,13,编辑版ppt,合适荧光素的选择：（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。,免疫荧光抗体技术(immunofluorescence antibody technique)是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。其中，最常用的是以荧光素标记抗体或抗抗体，用于检测相应的抗原或抗体。,第1节 免疫荧光抗体技术,14,编辑版ppt,免疫荧光抗体技术(immunofluoresce,免疫荧光抗体标记技术最早是由Coons等于1941年建立的。当时是用异氰

9、酸荧光黄(fluorescein isocyanate，FIC)来标记抗体，用于检测小白鼠组织切片中可溶性肺炎球菌多糖。但由于FIC分子难于标记到抗体分子上，因而限制了该技术的推广和应用。直到后来发现异硫氰酸荧光素(FITC)和其他荧光素分子，以及荧光抗体纯化技术的发展，显著提高了荧光抗体标记技术的敏感性和特异性，才使这一技术在病原微生物的检测、传染病的诊断、肿瘤抗原研究等方面得到了广泛的应用。,15,编辑版ppt,免疫荧光抗体标记技术最早是由Coons等于194,系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis，SLE)患者血清中出现抗细胞核抗体（ANA）。以小白鼠肝

10、细胞核作为抗原基质，加病人血清(第一抗体)，再加荧光标记的抗人IgG(第二抗体)进行间接免疫荧光试验，若患者血清中有ANA，即与肝细胞核抗原结合，再与荧光标记的抗人IgG结合，在荧光显镜下可见细胞核显示黄绿色特异荧光。,16,编辑版ppt,系统性红斑狼疮(systemic lupus erythem,二、荧 光 素 荧光素是能够产生明显荧光，并能作为染料使用的有机化合物，又称为荧光色素。只有具备共轭键系统，即单键、双键交替的分子，才有可能使激发态保持相对稳定而发射荧光，具有此类结构的主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。,17,编辑版ppt,二、荧 光 素17编辑版ppt,二、荧

11、光 素 作为蛋白质标记用的荧光素尚须具备：有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，而不形成有害产物；荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很小；结合物在一般贮存条件下稳定，结合后不影响抗体的免疫活性；作为组织学标记，结合物的荧光必须与组织的自发荧光(背景颜色)有良好的反衬，以便能清晰地判断结果；结合程序简单，能制成直接应用的商品，可长期保存。,18,编辑版ppt,二、荧 光 素18编辑版ppt,可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC，其中应用最广的是FITC，罗丹明只是作为前者的补充，用作对比染色时标记。,19,编辑版ppt,

12、可用于标记的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙,4种主要荧光素的化学结构,20,编辑版ppt,4种主要荧光素的化学结构20编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法(一)标本制备 1、标记要求：标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。同时还必须使抗原-标记抗体复合物易于接受激发光源，以便良好地观察和记录。这就要求标本要相当薄，并要有适宜的固定处理方法。,21,编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法21编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法(一)标本制备 2、标本处理方法：细菌培养物、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、尿沉渣等，可用涂片或压印片。组织学、细胞学和感染组

13、织主要采用冰冻切片或低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。细胞培养可用胰酶消化后作成涂片。细胞或原虫悬液可直接用荧光抗体染色后，再转移至玻片上直接观察。,22,编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法22编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法(一)标本制备 3、标本固定的目的：有两个目的，一是防止被检材料从玻片上脱落；二是消除抑制抗原抗体反应的因素(如脂肪)。检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于荧光抗体渗入。最常用的固定剂为丙酮和95乙醇。固定后应随即用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。,23,编辑版ppt,三、荧光抗体染色方法23编辑版ppt,(二)染色方法

14、荧光抗体染色法有多类，常用的有直接法和间接法。1、直接法：直接滴加2 4个单位的标记抗体于标本区，置湿盒中，于37染色30min左右，然后大量PBS（pH 7.07.2）中漂洗15min，干燥、封载即可镜检。直接法应设以下对照：标本自发荧光对照、阳性标本对照和阴性标本对照。直接法用于检测抗原，每检测一种抗原均需制备相应的荧光抗体。,24,编辑版ppt,(二)染色方法 荧光抗体染色法有多类，常用的有直接法和间接,2、间接法：将标本先滴加特异性的抗血清，置湿盒中，于37作用30min，漂洗后，再用标记的第2抗体(抗抗体)染色，漂洗、干燥、封载。对照除自发荧光、阳性和阴性对照外，间接法首次试验时应设

15、无中间层对照(标本+标记抗抗体)和阴性血清对照(中间层用阴性血清代替特异性抗血清)。既可用于检测抗原，又可用于检测抗体，而且制备一种荧光抗抗体即可用于同种属动物的多种抗原抗体系统的检测。,25,编辑版ppt,2、间接法：将标本先滴加特异性的抗血清，置湿盒中，于37,26,编辑版ppt,26编辑版ppt,五、免疫荧光抗体技术的应用,（一）、细菌学诊断 利用免疫荧光抗体技术可直接检出或鉴定新分离的细菌，具有较高的敏感性和特异性。链球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、布氏杆菌、炭疽杆菌等均可采用免疫荧光抗体染色进行检测和鉴定。粪便、黏膜拭子涂片、病变组织的触片或切片以及尿沉渣等均可作为检测样本，经直接

16、法检出目的菌，具有很高的诊断价值。,27,编辑版ppt,五、免疫荧光抗体技术的应用（一）、细菌学诊断 27编辑版pp,五、免疫荧光抗体技术的应用,（一）、细菌学诊断 对含菌量少的标本，可采用滤膜集菌法，然后直接在滤膜上进行免疫荧光染色，这一方法已在水的卫生细菌学调查、海水细菌动力学研究中得到应用。,28,编辑版ppt,五、免疫荧光抗体技术的应用（一）、细菌学诊断 28编辑版pp,以较低浓度的荧光抗体加入培养基中，进行微量短期的玻片培养，于荧光显微镜下直接观察荧光集落的“荧光菌球法”，已广泛用于下痢粪便中的病原体检测。尤其对于已用药物治疗的患者，在病因学诊断上有较大价值，因为在这种情况下培养病原

17、体常难于成功。,五、免疫荧光抗体技术的应用,（一）、细菌学诊断,29,编辑版ppt,以较低浓度的荧光抗体加入培养基中，进行微量短期的玻片,免疫荧光抗抗体间接染色法检测抗体，可用于流行病学调查、早期诊断和现症诊断。如钩端螺旋体IgM抗体的检测，可作为早期诊断或近期感染的指征。用间接法检出结核分支杆菌的抗体，可以作为对结核病的活动性和化疗监控的重要手段。,五、免疫荧光抗体技术的应用,（一）、细菌学诊断,30,编辑版ppt,免疫荧光抗抗体间接染色法检测抗体，可用于流行病学调查,(二)病毒病诊断 用免疫荧光抗体技术直接检出患畜病变组织中的病毒，已成为病毒感染快速诊断的重要手段。一般可在2h内做出诊断报

18、告。病原的鉴别诊断。,五、免疫荧光抗体技术的应用,31,编辑版ppt,(二)病毒病诊断五、免疫荧光抗体技术的应用31编辑版ppt,(二)病毒病诊断 对含病毒较低的病理组织，需先在细胞培养上短期培养增殖后，再用荧光抗体检测病毒抗原，可提高检出率。某些病毒在细胞培养上不出现细胞病变，亦可应用免疫荧光作为病毒增殖的指征。应用间接免疫荧光染色法以检测血清中的病毒抗体，亦常作为诊断和流行病学调查之用，尤以IgM型抗体的检出可供早期诊断和作为近期感染的指征。,五、免疫荧光抗体技术的应用,32,编辑版ppt,(二)病毒病诊断五、免疫荧光抗体技术的应用32编辑版ppt,(三)其他方面的应用 免疫荧光抗体技术已

19、广泛应用于淋巴细胞CD分子和膜表面免疫球蛋白(mIg)的检测，从而为淋巴细胞的分类和亚型鉴定提供研究手段。用抗IgM和IgG的抗血清标记SPA荧光菌体作荧光SPA花环试验，可计算带有mIgM或mIgG的B细胞的百分率。,五、免疫荧光抗体技术的应用,33,编辑版ppt,(三)其他方面的应用 五、免疫荧光抗体技术的应用33编辑版,免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，Nakane等和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术(enzyme-labelled antibody technique)，用于生物组织中抗原

20、的定位和鉴定。1971年，Engvall，VanWeemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。20世纪80年代，基于酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世。目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。,第2节 免疫酶标记技术,34,编辑版ppt,免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后,一、原 理,酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建起来的免疫检测技术。酶是一种有机催化剂，催化反应过程中酶不被消耗，能反复作用，微量的酶即可导致大量的催化过程，如果产物为有色可见产物，则极为敏感。

21、其催化过程是：E+S(ES)E+P；或E+S(ES),(ES)+D1 E+P+D2式中：E为酶；S为酶作用底物；P为底物分解后的产物；D1 为供氢体，无色，底物水解时，D1由还原型变为氧化型D2，呈现颜色反应。,35,编辑版ppt,一、原 理 酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的,酶标抗体技术的基本程序是：将酶分子与抗原或抗体分子共价结合，既不改变抗体免疫活性，也不影响酶的催化活性；将酶标抗体(抗抗体)与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原(抗体)发生特异性结合，并洗下未结合的物质；滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色，但在底物水解过程中由另外的供氢体提供氢离子，使供氢体由无色

22、的还原型变为有色的氧化型，呈现颜色反应。,36,编辑版ppt,酶标抗体技术的基本程序是：36编辑版ppt,可根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的抗原抗体反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗原(抗体)的量呈正比。此种有色产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到，或用分光光度计加以测定。这样，就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，用以在细胞或亚细 胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、纳克水平上测定它们的量。本法既特异又敏感，是目前应用最为广泛的一种免疫检测方法之一。,37,编辑版ppt,可根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的抗原抗体反应,二、用于标记的酶,用于标记的酶

23、应具有如下一些特点：高度的特异活性和敏感性；在室温下稳定；易于获得并能商品化生产；与底物反应的产物易于显现。常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以辣根过氧化物酶应用最广，其次为碱性磷酸酶。,38,编辑版ppt,二、用于标记的酶 用于标记的酶应具有如下一些特点：高,(一)辣根过氧化物酶 过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)。HRP是由五色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白(含糖18)，分子质量约为40ku。HRP的作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，使产生一定颜色的产物。如

24、果联苯胺为供氢体，反应式如下：,二、用于标记的酶,39,编辑版ppt,(一)辣根过氧化物酶 二、用于标记的酶39编辑版ppt,凡能在HRP催化H2O2生成H20过程中提供氢，而后自己生成有色产物的化合物(供氢体)都可用作显色剂。HRP的供氢体很多，根据供氢体的产物可分为两类：可溶性供氢体：产生有色的可溶性产物，可用比色法测定，如酶联免疫吸附试验中的显色剂，常用的邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)，显色呈橙色，最大吸收波长为490 nm，可用肉眼判定；3,3,5,5四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)，显色呈蓝色，加氰氟酸终止，在650nm波长下

25、测定，若用硫酸终止(变为黄色)则在450nm波长下测定。,二、用于标记的酶,(一)辣根过氧化物酶,40,编辑版ppt,凡能在HRP催化H2O2生成H20过程中提供氢，而,不溶性供氢体：产生不溶性的产物，最常用的是3，3二氨基联苯胺(3，3-diaminobenzidine，DAB)，反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物，可用光学显微镜和肉眼观察。用于各种免疫酶组织化学染色法、斑点-酶联免疫吸附试验和免疫转印。,免疫酶组织化学染色,斑点杂交,免疫转印,41,编辑版ppt,不溶性供氢体：产生不溶性的产物，最常用的是3，3二氨基联,(二)碱性磷酸酶(alkaline phospha

26、tase，AKP)：从小牛肠黏膜和大肠杆菌中提取。AKP的底物种类很多，常用对硝基苯磷酸盐，酶解产物呈黄色，可溶性，最大吸收波长为400nm。,二、用于标记的酶,42,编辑版ppt,(二)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，,(三)葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GO)，系从曲霉中提取，对底物葡萄糖的作用常借过氧化物酶及其显色底物来加以显现。如显色底物为邻苯二胺，则反应后呈棕色，阴性者为淡黄色，极易用目视法判别，其灵敏度高于过氧化物酶标记的抗体。,二、用于标记的酶,43,编辑版ppt,(三)葡萄糖氧化酶 二、用于标记的酶43编辑版ppt,戊二醛法或

27、过碘酸钠氧化法将酶标记于抗体分子。,三、抗体的酶标记,44,编辑版ppt,戊二醛法或过碘酸钠氧化法将酶标记于抗体分子。三、抗体的酶标记,四、常用的免疫酶标记技术,(一)免疫酶组织化学染色技术,1、标本的制备和处理:用于免疫酶染色的标本有组织切片(冷冻切片和低温石蜡切片)、组织压印片、涂片以及细胞培养的单层细胞盖片等。这些标本的制作和固定与荧光抗体技术相同，但尚要进行一些特殊处理。,45,编辑版ppt,四、常用的免疫酶标记技术(一)免疫酶组织化学染色技术1、标本,四、常用的免疫酶标记技术,(一)免疫酶组织化学染色技术,2、染色方法:可采用直接法、间接法、抗抗体搭桥法、杂交抗体法、酶抗酶复合物法、

28、增效抗体法等各种染色方法，其中直接法和间接法最常用。反应中每加一种反应试剂，均需于37作用30min，然后以PBS反复洗涤3次，以除去未结合物。,46,编辑版ppt,四、常用的免疫酶标记技术(一)免疫酶组织化学染色技术2、染色,(1)直接法 以酶标抗体处理标本，然后浸于含有相应底物和显色剂的反应液中，通过显色反应检测抗原抗体复合物的存在。(2)间接法 标本用相应的特异性抗体处理后，再加酶标记的抗抗体，然后经显色揭示抗原抗体抗抗体复合物的存在。,(一)免疫酶组织化学染色技术,47,编辑版ppt,(1)直接法 以酶标抗体处理标本，然后浸于含有相应底物和显,(3)抗抗体搭桥法 是利用抗抗体既能与反应

29、系统的抗体结合，又能与抗酶抗体结合(抗酶抗体与针对抗原的抗体必须是同源的)的特性，以抗抗体作桥连接抗体和抗酶抗体。先加抗体(如兔抗血清)使与标本上的抗原发生特异性结合，然后加抗抗体(羊抗兔血清)与抗体结合，再加既能与抗抗体结合又能与酶结合的兔抗酶抗体，最后用底物显色。,(一)免疫酶组织化学染色技术,48,编辑版ppt,(3)抗抗体搭桥法(一)免疫酶组织化学染色技术48编辑版,(3)抗抗体搭桥法 此法的优点在于：克服了因酶与抗体交联引起的抗体失活和标记抗体与非标记抗体对抗原的竞争，从而提高了敏感性；但抗酶抗体与酶之间的结合多为低亲和性，冲洗标本时易被洗脱，使敏感性降低。,(一)免疫酶组织化学染色

30、技术,49,编辑版ppt,(3)抗抗体搭桥法(一)免疫酶组织化学染色技术49编辑版,(4)酶抗酶复合物法：亦称PAP法。此法是将HRP和抗HRP抗体结合形成酶抗酶抗体复合物(PAP)，用PAP来代替抗抗体搭桥法中的抗酶抗体和酶。其敏感性较搭桥法高。本法亦可用于ELISA。,(一)免疫酶组织化学染色技术,50,编辑版ppt,(4)酶抗酶复合物法：亦称PAP法。此法是将HRP和抗HRP,(5)杂交抗体法：将特异性抗体分子与抗酶抗体分子经胰酶消化成双价F(ab)2片段，将这两种抗体的F(ab)2片段按适当的比例混合，在低浓度的乙酰乙胺和充氮条件下，使之进一步裂解为单价Fab片段，再在含氮条件下使其还

31、原复合。经分子筛层析后，即可获得2550的杂交抗体。这种杂交抗体分子含有两个抗原结合部位：一边能与特异性抗原结合；另一边能与酶结合。因此，不必事先制备标记抗体。检测标本直接用杂交抗体和酶处理，即可浸入底物溶液中，进行显色反应。杂交抗体还可采用杂交瘤技术和基因工程抗体技术进行制备。,(一)免疫酶组织化学染色技术,51,编辑版ppt,(5)杂交抗体法：将特异性抗体分子与抗酶抗体分子经胰酶消化成,(6)增效抗体法：同时使用酶标抗体与抗酶抗体，其程序为：抗原、酶标记抗体、抗抗体、抗酶抗体、酶、底物。此法能使更多的酶连接在抗原上，从而使显色反应增强，提高其敏感性。,(一)免疫酶组织化学染色技术,52,编

32、辑版ppt,(6)增效抗体法：同时使用酶标抗体与抗酶抗体，其程序为：抗原,3、显色反应 免疫酶组化染色中的最后一环是用相应的底物使反应显色。不同的酶所用底物和供氢体不同。同一种酶和底物如用不同的供氢体，则其反应物的颜色也不同。如辣根过氧化物酶，在组化染色中最常用DAB，用前应以005molLpH 7476的Tris-HCl缓冲液配成5075 mg100 mL溶液，并加少量(001003)H202混匀后加于反应物中置室温1030min，反应产物呈深棕色；如用甲萘酚，则反应产物呈红色；用4-氯-1-萘酚，则呈浅蓝色或蓝色。,(一)免疫酶组织化学染色技术,53,编辑版ppt,3、显色反应 免疫酶组化

33、染色中的最后一环是用相应的底物使反,4、标本观察 显色后的标本可在普通显微镜下观察，抗原所在部位呈色。亦可用常规染料作反衬染色，使细胞结构更为清晰，有利于抗原的定位。本法优于免疫荧光抗体技术之处，在于毋须应用荧光显微镜，且标本可以长期保存。,(一)免疫酶组织化学染色技术,54,编辑版ppt,4、标本观察 显色后的标本可在普通显微镜下观察，抗原所在部,(二)酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，ELISA是应用最广、发展最快的一项新技术。其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用

34、肉眼或分光光度计判定结果。,55,编辑版ppt,(二)酶联免疫吸附试验 55编辑版ppt,56,编辑版ppt,56编辑版ppt,酶标抗原竞争法：用特异性抗体包被固相载体，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原共同孵育，对照仅加酶标抗原，洗涤后加入酶底物。被结合的酶标记抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定。如待检溶液中抗原越多，被结合的酶标记抗原的量越少，显色就越浅。可用不同浓度的标准抗原进行反应绘制出标准曲线，根据样品的OD值求出检测样品中抗原的含量。,57,编辑版ppt,酶标抗原竞争法：57编辑版ppt,抗体稀释及加样方法,500l样品稀释液,女,女,500lE-Ab,第2列：阴

35、性对照（Ag+/Ab-）第10列：空白对照（Ag-/Ab-）,1.准备6个稀释管，做好标记。2.先在每个稀释管中加入稀释液500ul。3.取出500ul抗体加入第一管，混匀后，取出500ul加入第二管，依此类推至最后管。,58,编辑版ppt,抗体稀释及加样方法500l女女500l阴原1:21:41,封闭的作用,包被时所用的抗原或抗体浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止非特异性吸附，影响结果的准确性。如图：,59,编辑版ppt,封闭的作用包被时所用的抗原或抗体浓度较低，吸收后固相载体表面,TMB（四甲基联苯胺）,TMB经HRP作用后其

36、产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。酶反应用HCL或H2SO4终止后，产物由蓝色变成黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。TMB有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。,60,编辑版ppt,TMB（四甲基联苯胺）TMB经HRP作用后其产物显蓝色，目视,固相载体 有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。用聚苯乙烯微量滴定板(40孔或96孔板)是目前最常用的载体，小孔呈凹形，操作简便，有利于大批样品的检测。新板在应用前一般无需特殊处理，直接使用或用蒸馏水冲洗干净，自然干燥后备用。一般均一次性使用，如用已用

37、过的微量滴定板，需进行特殊处理。,61,编辑版ppt,固相载体 有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。用聚苯乙烯,结果判定 ELISA试验结果可用肉眼观察，也可用ELISA测定仪测定样本的光密度(0D)值。每次试验都需设阳性和阴性对照，肉眼观察时，如样本颜色反应超过阴性对照，即判为阳性。用ELISA测定仪来测定OD值，所用波长随底物供氢体不同而异，如以OPD为供氢体，测定波长为492nm，TMB为650nm(氰氟酸终止)或450nm(硫酸终止)。,62,编辑版ppt,结果判定 ELISA试验结果可用肉眼观察，也可用ELISA,(三)斑点-酶联免疫吸附试验 斑点-酶联免疫吸附试验(Dot-ELI

38、SA)，此法的原理及其步骤与ELISA基本相同，不同之处在于：一是将固相载体以硝酸纤维素滤膜、硝酸醋酸混合纤维素滤膜、重氮苄氧甲基化纸等固相化基质膜代替，用以吸附抗原或抗体；二是显色底物的供氢体为不溶性的。结果以在基质膜上出现有色斑点来判定。可采用直接法、间接法、双抗体法、双夹心法等。,63,编辑版ppt,(三)斑点-酶联免疫吸附试验 63编辑版ppt,64,编辑版ppt,64编辑版ppt,65,编辑版ppt,65编辑版ppt,一、原理,放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是将放射性同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术。1959年

39、，Yalow和Berson共同建立了放射免疫分析，由于这种检测方法可以精确地测定体液中的微量活性物质，是免疫定量分析技术的一次重大突破和飞跃，因而受到各有关基础学科工作者的重视，并于1977年荣获诺贝尔生物学医学奖。放射免疫分析经过多年的发展和完善，已由经典的液相方法发展到固相操作，方法越益简化，并可自动化分析。,第3节 放射免疫分析,66,编辑版ppt,一、原理 放射免疫分析(radioimmunoassa,放射免疫分析的基本原理是标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应。根据免疫沉淀物中Ag*-Ab量减少或增多来测定Ag的量。,67,编辑版ppt,放射免疫分

40、析的基本原理是标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag,68,编辑版ppt,68编辑版ppt,二、常用的放射免疫分析技术,(一)液相放射免疫测定 通常所指的放射免疫分析主要是指液相法。由于待测物的性质和所标记的同位素不同，液相放射免疫的具体方法千差万别。但均需先用标记抗原、已知量的标准抗原和抗血清进行预试，根据测定结果绘制标准曲线。,69,编辑版ppt,二、常用的放射免疫分析技术(一)液相放射免疫测定 69编辑,(二)固相非竞争放射免疫测定法 本法系预先将抗原或抗体联接在固相载体上(聚苯乙烯或硝酸纤维素膜)上，制作免疫吸附剂，然后按照ELISA相同步骤，使反应在同一管内进行，操作简便快速，特别适合

41、于制成标准试剂盒，便于推广到基层医疗单位应用。固相载体通常以聚苯乙烯制成小管或小珠，反应在管壁或小珠表面进行。也可用薄型塑料压制成微量滴定板，反应后可将各孔剪下，分别测定脉冲数。试验方法分单层法和夹心法。,70,编辑版ppt,(二)固相非竞争放射免疫测定法70编辑版ppt,三、放射免疫分析的应用,放射免疫分析是目前最敏感的分析技术，其灵敏度是任何化学分析方法所无法以拟的。但需制备高纯度抗原、标记抗原和高亲和力的标准抗血清。目前，多由放化研究中心制成药盒供应。在国内，如前列腺素、孕酮等已有药盒供应。本法主要用于各种生物活性物质的检测。据不完全统计，目前可用本法分析的项目已达300多项，其运用范围

42、遍及生物科学的各个方面。在基础医学和临床医学中应用的主要方面：,71,编辑版ppt,三、放射免疫分析的应用 放射免疫分析是目前最敏感的分析,(一)疾病的诊治 本法除诊断传染病、寄生虫等疾病外，还广泛应用于各种内分泌疾病、心血管疾病和肿瘤的诊断。,(二)激素等微量活性物质的测定 动物体的各种生理活动都是通过激素、酶和其他活性物质传递信息和调节机能而得以实现的。研究生理和病理过程各类生物活性物质的动态，对探讨它们的生理功能、探索新治疗途径都有重要意义。,72,编辑版ppt,(一)疾病的诊治 本法除诊断传染病、寄生虫等疾病外，还广泛,还可采用放射性磷、锶等同位素敷贴疗法治疗血管瘤、湿疹、角膜炎症等浅

43、表部位的皮肤病和眼科疾病。此外，钴治疗机、电子感应加速器、直线加速器等外照射治疗已成为治疗恶性肿瘤的重要手段，在癌症治疗中所占的比重高达70左右,而且遍及癌症的绝大部分病种。,73,编辑版ppt,还可采用放射性磷、锶等同位素敷贴疗法治疗血管瘤、湿疹,核射线有杀伤细胞的能力。用放射性碘治疗甲状腺功能亢进,是内服同位素疗法中最成功的例子。,74,编辑版ppt,核射线有杀伤细胞的能力。用放射性碘治疗甲状腺功能亢进,是内服,(三)药物监测 药物的有效作用主要决定于体液中药物的浓度，但由于检测困难，过去的给药剂量都凭在治疗过程中的经验积累。应用放射免疫分析法建立了体液中药物浓度的定量技术，这是近代药物学

44、的一个重大突破。药物的临床监测对治疗的帮助是显而易见的。,75,编辑版ppt,(三)药物监测 75编辑版ppt,监测中毒或用药过量、提供调整药物剂量的根据、检查病人是否按照医嘱用药、研究某种药物在体内的分布动态、为合理用药提供依据等。应用放射免疫技术对血清及组织中药物浓度的测定是当前发展最快的项目之一。每一种新药问世，都要建立测定该药的放射免疫分析方法，可见这一技术的药物研究中的重要意义。,76,编辑版ppt,监测中毒或用药过量、提供调整药物剂量的根据、检查病人,在运动场上判断一个运动员获得最佳成绩是否是由于服用某种兴奋剂所致，只要用放射免疫方法测一下运动员的尿，就可立即得出正确的结论。在法医上可用它测定毒药的性质和剂量，为迅速破案提供有力证据。,77,编辑版ppt,77编辑版ppt,