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1、A Introduction to Chromatography,2006.07,Column chromatographyPre TLC,Column Chromatography,柱层,原理 吸附剂 相互作用 影响分离的参数 装柱 上样 洗脱技术 柱的监控,有机化学家能用的最现代化和尖端的方法全部包括某种类型的层析法.层析法的定义是,通过在两相之间的分配,使一个由两种或多种不同化合物(有时是离子)组成的混合物得到分离,这两相中一相是固定的,另一相则是移动的.根据所包括的两个相的性质,可有各种可能形式的层析法;供普通使用的有固-液(柱,薄层和纸),液-液和气-液(蒸气相)层析法.所有层析法所
2、根据的工作原理都是凭借于欲待分离的几种物质在将它们进行分配的两相之间的溶解度(或吸附度)上的差别.,原理,吸附剂,柱层析法是以吸附度和溶解度这两者为根据的一种技术,它是一种固-液相间进行分配的技术.其中的固体几乎可以是任何物料,只要不溶解于附着的液相中即行.但最常用的一些固体是硅胶(SiO2 xH2O)也叫做硅酸,和氧化铝(Al2O3 xH2O).这些化合物均用其粉状或磨细的形式(通常为200至400目)层析法中所用的极大多数氧化铝系从粗的铝矿石(Al2O3 xH2O+Fe2O3)制得.将铝土矿石溶于热氢氧化钠溶液中,过滤除去不溶的氧化铁;矿石中的氧化铝则成为可溶性的两性氢氧化物 Al(OH)
3、4-.这个氢氧化物用CO2(它能降低PH)使沉淀成为 Al(OH)3,在加热时,此Al(OH)3失水成为纯的 Al2O3.,吸附剂,按此方法制得的氧化铝称为碱性氧化铝.因为它仍旧含一些氢氧化物.碱性氧化铝不能用于对碱敏感的化合物的层析分离.因此,要用酸加以洗涤以便将碱中和,这样便得到酸性氧化铝.这种物料仍然不能令人满意,除非经过足够的水洗以除去所有的酸,才能获得最适用于柱层析的物料,称为中性氧化铝.如果化合物是酸敏感的,必须使用碱性或中性氧化铝,必须仔细的弄清你在层析法中所用的氧化铝属於哪一类型.硅胶除了以适用于层析法的形式供应外别无任何其他类型.,相互作用,若将粉末状或磨细的氧化铝(或硅胶)
4、加入至含有一种有机化合物的溶液中时,一部分有机物将会吸附或黏在氧化铝细粒上,使有机分子和氧化铝结合的力有好几种.这些力按其种类不同,强度不一.非极性化合物只用范德华(Van der waals)力与氧化铝结合.这种力较弱,故非极性化合物不能结合得很牢除非它们的分子量非常大.极性有机化合物所用的相互作用力则较为重要,此中所用之力或为 偶极-偶极相互作用力,或为某种 直接的相互作用力(配位作用,氢键,或盐的形成等).,相互作用,这些相互作用的强度变化次序大致是:盐的形成配位作用氢键偶极-偶极相互作用力范德华力,相互作用,对於溶解度来说,也有类似的法则.极性溶剂对极性化合物的溶解比非极性溶剂更为有效
5、;非极性化合物则最易被非极性溶剂所溶解.因此任何一个给定溶剂洗下吸附在氧化铝或硅胶上的化合物的能力大小几乎直接决定于该溶剂的相对极性.对於每一被吸附着的物料来说,可以想象它们在吸附剂和溶剂之间都有一种分配平衡,即不断地从溶液中吸附分子又不断地向溶液中解吸分子.达到平衡时最终被吸附在颗粒上的分子的平均数既取决于所涉及的特殊分子又取决于吸附剂必须与之竞争的溶剂的溶解效力.,影响分离的参数,层析法是分离混合物的常用方法,许多可以改变的因素使层析法成为一种多方面适用的方法.这些因素包括:1.选定的吸附剂2.选定的溶剂极性3.相对于需待分离的物料量的柱子尺寸(长度和直径)4.洗脱(或流动)的速率,A.吸
6、附剂,吸附剂的选择通常要根据需待分离的化合物的类型而定.主要有:纤维素,淀粉和糖类:用于对酸碱相互作用非常敏感的多官能团的动,植物性化合物(天然产物)硅酸镁:分离乙酰化的糖类,甾体化合物和香精油.硅胶和合成硅酸镁载体(Florisil):对大多数化合物来说相对地比较温和,故可广泛适用于种种官能团烃,醇,酮,酯,羧酸,偶氮化合物,胺.,吸附剂,氧化铝:分为酸性(PH=4),中性,碱性(PH=10).这种吸附剂特别适用于分离象羧酸和氨基酸之类的酸性物质.碱性氧化铝的PH约为10,故适用于分离胺.中性氧化铝可用于分离各种非酸性和非碱性物质.,吸附剂,*应该特别注意的是,这个次序是近似的,可变的.如氧
7、化铝和硅胶的强度或分离能力在很大程度上取决于其中所存在的水.水能非常紧密地与这两种吸附剂结合,占去颗粒上的一些部位,这些部位本来是可供平衡用的.因此如果将吸附剂里面加进水,我们便称为失活.无水氧化铝或硅胶则是高度活化的,这种高活性是吸附剂需要避免的,因为这种高活性会使得吸附剂和待分离的化合物发生某些形式的破坏作用和分解作用,往往能引起某些类型的溶质化合物发生分子重排反应.,B 溶剂,各类溶剂的极性次序如下表:,溶剂,在层析分离过程中,若拟改变溶剂的极性,要采取一些预防措施.务须避免迅速从一种溶剂换成另一种溶剂(尤其是当使用硅胶或氧化铝时).通常,应将新溶剂以小百分比慢慢混入正在使用的溶剂中.如
8、不这样做,柱内填重料往往会出现缝隙.缝隙之所以发生是由於氧化铝或硅胶与溶剂混合时放热所致.溶剂将吸附剂溶剂化,从而形成一种弱键而放出热量.溶剂+氧化铝(氧化铝 溶剂)+热 往往能在局部地方生成足能使溶剂蒸发的热量.蒸气的产生造成了气泡,气泡又把柱内填充料挤开,这就是所谓的缝隙.,溶剂,使用氧化铝或硅胶时,要避免使用某些溶剂,特别是酸性的,碱性的和高活性形式的溶剂.举例来说,丙酮会与任何一个这样的吸附剂通过醇醛缩合作用二聚成乙酰丙酮.当用乙酸乙酯或醇类作为洗脱液时,会使酯类的混合物发生酯交换作用.最后,更活泼的溶剂(吡啶,甲醇,水和乙酸)会溶解和洗脱一部分吸附剂本身.,溶剂,溶剂,一般来说,各类
9、化合物被洗脱时,非极性化合物最先洗脱,极性化合物最后洗脱.可是,分子量也是一个决定洗脱次序的因素.高分子量的非极性化合物将比低分子量的非极性化合物洗脱得慢,甚至可能被某些极性化合物所超过.具有下列极性基团的化合物,其吸附能力按下列排列次序递增:,C 柱的尺寸和吸附剂量,为了能使一定数量的样品达到良好分离,还应正确地选定柱尺寸和吸附剂的量一条经验规律是,吸附剂的量应是需待分离的混合物重量的25至30倍.另外,所用柱子的高度和直径之比应大约为8:1.但要注意的一点是,柱的尺寸和长度及需用吸附剂的量还决定于分离的困难程度.不易分离的化合物可能需要更长的柱子和更多的用量.,柱的尺寸和吸附剂量,某些典型
10、样品量适用的柱尺寸和吸附剂数量 样品量 吸附剂量 柱直径 柱高 0.01g 0.3g 3.5mm 30mm 0.1g 3g 7.5mm 60mm 1.00g 30g 16.0mm 130mm 10.00g 300.0g 35.0mm 280mm,D 流速,溶剂流经柱子的速率对於决定一个分离能进行得多好也起着作用.一般来说,需待分离的化合物在柱上逗留愈久,其在固定相和移动相之间的平衡愈广泛.结果可以使较为相似的化合物得到分离.然而如果流速过慢,则混合物中各个物质到了溶剂中后其在溶剂中的扩散速率可能变得大於这些物质沿柱下行速率.在这种情况下谱带变宽,反而使分离效果变差.事实上,在溶剂极性相同的情况
11、下,溶剂的流速一般而言（HPLC，MPLC除外），流速均以越快越好，因为一般而言流动相流速与板高成反比，而板高越小越好，所以流动相流速越快越好。所以快速,流速,（加压）柱层析的效果比一般重力柱层析好。,装柱,柱层析法中最关键性的操作是装柱.柱子在用吸附剂填充时必须装得非常均匀,如果装得不整齐,出现气泡,缝隙等会明显影响分离效率.主要存在两种情况:一:谱带的最前面的边缘或称前沿不水平,如果两条谱带紧靠在一起而又无水平的谱带前沿,那么要想收集每一条谱带而把另外一条谱带完全排除在外是不可能的!造成这个问题的因素有两个:1.吸附剂填充料的顶面不呈水平.2.柱子未被夹持在两个平面中(即前-后,左-右两个
12、平面)完全垂直的位置.,装柱,二:谱带前沿的一部分从谱带的主体部分中间向前伸出,此时发生的现象称为流动或称沟流.造成这种现象的原因主要是吸附剂表面不平整或在填料中有任何不平整性或气泡.,装柱,A 湿法(浆液法)即吸附剂以浆液状态被装入管内.浆液是一种溶剂和一种不溶解的固体的混合物.操作方法是将固体吸附剂慢慢加入盛有大量溶剂的容器中.注意要严格遵守这种加料次序(加吸附剂至溶剂),因为吸附剂在加入到溶剂中时会因溶剂化效应而放热.若向吸附剂内加溶剂,由於发热会使溶剂几乎与加入速率一样快地气化逸出,使最终的混合物不均匀或结块.因此通常的做法是将吸附剂加入溶剂中,边加边旋摇,使其形成一种稠厚但能流动的浆
13、液.浆液应不断旋摇直至已呈均匀状态且相对地不再含有空气泡为宜.,装柱,装柱时,先向柱内充入溶剂至约半满,然后开启活塞让溶剂慢慢流下,借助旋摇动作使浆液混合,然后慢慢倾入正在流出溶剂的柱子的顶部.同时要不断轻轻地敲击柱壁,促进均匀沉降和混合,避免空气泡的形成.同时在所有物料沉降好之前要持续轻敲柱壁,这样可以使柱顶形成一个非常合格的水平面.另外如果浆液有时因变得太厚而无法倾倒,可将收集在烧杯中的溶剂重新加至浆液内.然后将收集到的溶剂在柱内反复循环几次以保证沉降完全及柱子的紧实.,B 干法,方法一:用溶剂将柱子充满并让它缓缓流出.在按上述方法不停地轻敲柱子的同时,每次少量地把干的吸附剂加入柱中.此法
14、也可得到装得很均匀的柱.同上法一样,每次使用前应将溶剂反复循环通过几次.方法二:先将干的吸附剂装入柱中,硅胶面压实顶部水平后将溶剂缓慢渗沥穿过柱子,直至柱子全被浸润.但此法容易造成柱子不匀,空气泡和缝隙,尤其是使用在溶剂化过程中有高度放热的溶剂时,这些问题尤为突出.,上样,分为以下几个步骤:将固体样品溶于极少量适宜的极性溶剂中,溶剂的极性应比样品的极性小一些,否则样品不易被吸附.溶剂对样品的溶解度也不宜过大.通过排液,使溶剂的水平面刚好低于吸附剂的顶部.将待分离的溶液用移液管(或长滴管)加入柱顶.注意要接触柱的内壁慢慢沿柱壁散布放样使其慢慢下降.从而使整个吸附剂表面都被其均匀地盖住.同时要注意
15、尽量使移液管贴近吸附剂表面.,上样,D 让这一薄层液体进入柱内,直至柱顶表面恰好开始沥干为止.E:小心用移液管加入一薄层层析分离溶剂,小心不要搅动表面,让这一薄层溶剂排入柱中直至这段柱正好沥干,目的是洗涤柱壁上附着的样品.如样品有色,则可从新鲜溶剂层上有没有这种样品的颜色来判断样品有没有被完全吸附.F:向柱顶加入石英砂并注入溶剂.,上样,*在开始洗脱之前让样品在柱中停留一段短时间往往可以得到较好的分离,这样做可以建立起一个真正的平衡.然而,必须指出,在一个经过长时期放置的柱中,吸附剂往往会变得紧密甚至溶胀,而流速也可能变得令人讨厌地慢.如果柱子放置时间过长,也会出现样品扩散而使谱带变宽的问题.
16、,洗脱,洗脱溶剂的选择是柱色谱分离的重要环节.通常先用非极性溶剂洗脱出极性小的部分,再慢慢加大极性进行洗脱.常用溶剂和混合溶剂的洗脱力按递增次序排列如下:己烷和石油醚 环己烷 四氯化碳 三氯乙烯 二硫化碳 甲苯 苯 二氯甲烷-乙醚(80:20)二氯甲烷-乙醚(60:40)环己烷-乙酸乙酯(20:80)乙醚 乙醚-甲醇(99:1)乙酸乙酯 四氢呋喃 丙酮 正丙醇 乙醇 甲醇 水 吡啶 乙酸 甲酸,柱的监控,一:通过薄层层析板进行监控二:通过加入无机荧光体.当用紫外光照射时,经过此处理的吸附剂会发荧光.但也有一些溶质有使这种荧光体指示剂的荧光淬灭的能力,因此在有这些溶质存在的区域,吸附剂将不发荧光
17、,从而可以看到一条暗谱带.,拖尾会干扰第二个组份的分离,避免的一个办法是在洗脱时不断地提高溶剂的极性.用这种方法时,由於在峰的尾部处极性正在增大,化合物就会比其前缘处移动得快,从而使尾部紧缩,形成一个更近乎理想的谱带,拖尾,几点注意,1.层析样品的RF值（Retenition fraction）是指样品中心区与流动相前端距起始点的距离的比值,几点注意,2.任何化合物若以TLC检验其纯度，其所显示的Rf值超过0.7或低于0.1时，均无法确认其是否为单一点，因为在此种Rf值时，许多Rf值较接近的点均有可能重合。所以我们选择观察物最适合的Rf值为0.30.5。3.过柱子时所选用的溶剂系统应配合选用硅
18、胶的用量及样品的量来选择其极性组合，一般而言欲分离的主样品Rf值以0.150.25为宜。,几点注意,4.一般最常用的溶剂系统依其极性大小依次为正己烷（或石油醚）乙酸乙酯甲醇的组合为最通用，其他如乙醚也常为中极性的溶剂，对含氯有机溶剂如DCM，CHCl3常有特殊的效果，而笨对含芳香性的化合物也会有出人意料的好效果。5.过柱子所用的溶剂在配好后，应以TLC再作检查试一次，以确定是否为恰当的溶剂体系。,几点注意,6.在填装层析柱时若不慎有气泡（如溶剂部分流干引起）可补满溶剂后以木棒轻敲管壁，使气泡浮出。因为气泡中没有填充物，分离物流经此处时移动速度会较其他处为快，而造成此处分离物与其他无气泡处的分离
19、无排列次序混乱，影响分离效果。7.在过柱子时所收集的馏分体积通常为硅胶克数的1/4以下。实际情况可引用下列公式求出粗略值，如欲分离成分A与B，而A的Rf值为0.3，B的Rf值为0.2，则最合适的分离体积为：设硅胶量为50g V2 x W x(RfA-RfB)=2 x 50 x(0.3-0.2)=10 ml,PTLC,分离时间短，效率高 操作简便 分离样品少,特点,原理,各组分对吸附剂吸附能力不同 吸附能力弱（即极性较弱的）随流动相移动 吸附能力强（即极性较强的）随流动相移动慢,PTLC 板,吸附剂 最常用的吸附剂是硅胶 硅胶是无定型多孔物质，略具酸性 适用于中性或酸性物质的分离。制备和活化 负
20、载量 1.0mm，5mg/cm2 e.g.20 20cm,10100mg,确定展开剂 上板 展板 显色 刮板与洗脱,PTLC过程,确定展开剂,溶解样品时应选用溶解度大，沸点低、易挥发的溶剂 溶剂量控制在1.52ml/块板 产物的Rf值调至0.40.6 P-TLC可直接用TLC条件,上板,准备硅胶板 自制的一次性滴管 上板次数4次 左右约1cm处不上样 写上化合物编号,用滴管吸取样品溶剂，缓慢并且匀速地在板上划一条直线 如果点样太宽，可用大极性溶剂将其展开至24cm，再吹干不要污染板线条尽可能细如果可能，点样后先在 UV下检查 小心:UV 光线直接照射进眼里是有害的,最好带上眼镜，并用镊子夹住板
21、样品不能太多，否则会过载由于边缘厚度不均匀及边缘效应,应留 58mm.,CONFIDENTIAL,展开缸展开剂量为15-20ml/块板 吹板在前沿距P-TLC板上端约1cm时取出 展开剂,展板,正己烷（石油醚）/乙酸乙酯 氯仿/甲醇 正己烷（石油醚）/丙酮,几个常用的溶剂体系,选择溶剂系统，必须经过多次的尝试，不断改变溶剂极性，根据板层情况，选择最佳的溶剂体系一般来讲，提高溶剂极性，化合物爬的越高（反之则相反).,溶剂（展开剂）烷烃(己烷,石油醚)甲苯二氯甲烷,氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮醇醋酸,极性,显色,化合物有紫外，在紫外灯下用铅笔将产物色带划出。化合物无紫外，柱层析或用玻璃刀将对照点划下，用相
22、应的显色方法测出产物带后，根据Rf值确定产物带。,刮板与洗脱,用刮刀将产物色带刮下后，研细。洗脱剂一般不用甲醇、四氢呋喃、DMF和DMSO等极性大或沸点高的溶剂洗脱。玻璃漏斗洗脱或柱层析洗脱,板上的化合物是一片 样品过载 或者是由于你的样品十分不纯 板上的化合物拖尾 样品有酸性或碱性基团(胺或羧酸)有时在PTLC板会有严重的拖尾。加入几滴氨水或TEA(胺)或醋酸(羧酸),PTLC中的问题,尽快处理你的化合物,长时间与吸附剂接触会增加你的样品变坏的可能性 小心选择溶剂,甲醇可能会溶剂硅胶板里的融解黏合剂及荧光物质,选择氯仿，丙酮和乙醇会好一些;如果可能的话，尽量选择低极性的溶剂 1g吸附剂需用大约5ml溶剂 柱层析有助于除去黏合剂和荧光物质,操作过程请注意,Thanks,
