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1、核酸分子杂交技术高俊燕,博奥生物集团有限公司生物芯片北京国家工程研究中心北京博奥晶典生物技术有限公司,Contents,目录,2,目 录,Contents,3,4,核酸分子杂交的基本理论,核酸分子杂交具有互补序列的两条单链核酸(DNA或RNA)分子在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则退火形成双链杂合体的过程称为核酸分子杂交。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它是基于DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分
2、子的过程。分子杂交实验依据其形式的不同可以分为液相杂交和固相杂交，各类型杂交的基本原理和步骤是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。,5,核酸分子杂交的基本理论,关键步骤：变性杂交（复性）检测信号结论,核酸分子杂交的基本理论,DNA变性1、定义：在某些理化因素作用下，两条DNA链间的氢键断裂，变为单链的过程称DNA变性。2、变性的方法：1）热变性：温度升高到90100时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂,6,核酸分子杂交的基本理论,3、影响变性的
3、因素1）碱基组成：DNA分子中GC含量越高Tm越高。2）溶液的离子强度：DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们之间的静电相斥作用是其双链的不稳定因素之一。在无盐的水中，DNA在室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA稳定性增加，Tm值升高。3）pH值：pH值在59范围内，Tm值变化不明显。在高pH值下，可使碱基失去形成氢键的能力。当pH大于11.3时所有氢键均被破坏，DNA完全变性。4）变性剂：可以干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50的甲酰胺以使Tm值降低30。,7,核酸分子杂交的基本理论,4、核酸溶液变性后的理
4、化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程）,8,核酸分子杂交的基本理论,DNA复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA 和 寡核苷酸/RNA。2、复性过程1）单链分子间碰撞形成局部双链2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列3）形成完整的双链分子,9,核酸分子杂交的基本理论,3、影响复性的因素1）DNA浓度 DNA浓度越大
5、复性速度越快 单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1-0.5g，浓度过高影响杂交效率2）DNA的分子质量大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢,10,核酸分子杂交的基本理论,3）温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性 DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25 RNA/DNA 或 RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（原位杂交时，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,11,核酸分子杂交的基本理论,4）离子强度通常盐浓度较高时，复性速度较快。5）甲酰胺甲酰胺能降低核酸杂
6、交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542 杂交；如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,12,核酸分子杂交的基本理论,6）核酸分子的复杂性同样条件下，DNA序列简单的分子复性快，序列较复杂的DNA分子复性则较慢。7）非特异性杂交反应：杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,13,目 录,Contents,14,核酸探针及其标记,探针的概念核酸探针(probe)是指用放射性核
7、素或其它标记物标记的已知序列的核酸片段。长度一般以50300bp为宜。制备方法：(1)DNA重组技术(2)PCR扩增(3)化学合成,15,核酸探针及其标记,核酸探针的种类1）基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。2）cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。3）RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。复杂性低，杂交效率高，但易降解，标记方法复杂。4）人工合成的寡核苷酸探针：检测点突变和小段碱基的缺失或插入,16,17,核酸探针的标记,为
8、确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。理想标记物应具备的特性：高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,核酸探针及其标记,核酸分子杂交技术的广泛应用，在很大程度上取决于高敏感性检测的各种标记物。根据标记物本身的性质及检测特点，可分为放射性核素及非放射性物质的标记物。,核酸探针及其标记,1、放射性标记物放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。优点：灵敏度高，可检测到10-181
9、0-4g的物质；很高的特异性，假阳性结果较少。缺点：辐射危害（易造成放射性污染）同位素的半衰期限制2、非放射性标记物生物素、地高辛精、荧光化合物,18,目 录,Contents,19,20,切口平移法（nick translation labeling),是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶 I 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。1）利用DNase I在DNA双链上造成单链切口2）利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除
10、3）在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,核酸探针的标记方法,21,22,23,随机引物法,其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。随机引物法所具有的优点：1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌
11、握不当所带来的一系列问题3、标记活性高4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,核酸探针的标记方法,24,25,末端标记法(terminal labeling)1）3末端标记 在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的-32PdNTP。3末端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3标记有两种方式：大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法和T4DNA聚合酶标记法 2）5末端标记先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，在T4多核苷酸激酶的催化下，使 ATP分子上的磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5OH基团上。因此采用-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5端标记。但核酸样品5
12、端必需是去磷酸的。,核酸探针的标记方法,26,PCR标记法,将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,核酸探针的标记方法,非放射性物质标记目前用得最多的是生物素和地高辛精,目 录,Contents,27,核酸分子杂交方法,Southern 印迹杂交（Southern blot）Northern 印记杂交（Nouthern blot）斑点印迹杂交（dot blotting）狭线印迹杂交（slot blotting）原位杂交,28,Southern 印迹杂交 使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标
13、记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。1975年，苏格兰爱丁堡大学E.M.Southern首先设计出来的，故又称Southern blot。,Edwin Mellor Southern,核酸分子杂交方法,29,核酸分子杂交方法,Southern杂交的主要步骤：1）待测核酸样品的制备2）待测DNA样品的电泳分离3）凝胶中DNA的变性：碱变性（NaOH溶液）4）Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法5）Southern杂交6）杂交结果的检测,30,31,Southern blot操作流
14、程,核酸分子杂交方法,Southern杂交 的主要应用1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.PCR产物分析,32,核酸分子杂交方法,Northern印迹杂交1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法因这种方法与Southern blot 杂交技术十分类似，与DNA的杂交（Southern 杂交）相对应，被称为Northern杂交。基本原理和基本过程与Southern blot基本相同鉴别RNA探针可用DNA或RNA片段待测样品为总RNA或mRNA,33,Northern印迹与Southern
15、 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解（变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制环境），DNA电泳前和电泳中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA,核酸分子杂交方法,Hybridization of Nucleic Acids,RNA,DNA1,DNA2,DNA,Southernhybridization,Northernhybridization,探针,核酸分子杂交方法,斑点印迹杂交（dot blotti
16、ng）狭线印迹杂交（slot blotting）更适于核酸样品的定量检测原理与Southern杂交相同将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上在实验过程中，使用特殊设计的加样装置，使众多的待检测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵,36,核酸分子杂交方法,37,斑点及狭缝印迹杂交的特点斑点印迹为圆形狭缝印迹为线状鉴别DNA、RNA简单、快速，同一张膜可检测多个样品特异性不高、不能鉴别核酸分子量,核酸分子杂交方法,原位杂交将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/D
17、NA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。,38,核酸分子杂交方法,原位杂交过程：1）组织或细胞的固定2）组织细胞杂交前的预处理去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落,39,核酸分子杂交方法,3）探针的选择与标记以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般
18、为50300bp,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定，检测结果分辨率高，但 信号检测时间长非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察,40,核酸分子杂交方法,4）杂交杂交液体积小：1020lcDNA和RNA探针杂交温度约为50杂交时间:DNA探针杂交为24h,RNA探针杂交过夜杂交前一般将组织切片置95 515分钟使DNA变性冲洗温度一般 不超过50 5）杂交结果检测所用探针为核素标记,放射自显影检测所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测,41,目 录,Contents,42,DNA芯片技术,DNA芯片属于生物芯片的一种，是基于核酸分子杂交的基本原理，以大量已知
19、序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作为探针，以显微打印的方式有序地固化在支持物表面，然后再与经过标记的样品核酸分子杂交，通过对杂交信号进行定性定量分析，获得待测样品中的基因序列表达信息。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。,43,DNA芯片技术,DNA芯片技术的基本原理DNA芯片技术的原理是分子识别，与Southern杂交和Northern杂交同出一理，即DNA的碱基互补配对和序列互补原理。DNA芯片的分类据芯片的性能与用途分：毛细管型微芯片 基因探针型微芯片据DNA芯片上微排列的DNA不同分：寡核苷酸芯片 cDNA芯片,44,DNA芯片技术,DNA芯片的技术流程制作芯片待测样品的制备标记的靶DNA与芯片上的核酸探针杂交杂交信号的检测和结果分析,45,DNA芯片技术,DNA芯片技术的应用可广泛应用于基因表达的检测，寻找未知基因、杂交测序、基因突变和基因多态性分析等药物筛选和新药开发方面优势明显人类疾病的诊断,46,博奥生物集团有限公司生物芯片北京国家工程研究中心北京博奥晶典生物技术有限公司,
