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1、激光扫描共聚焦显微技术,Laser scanning confocal microscopy,激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面3.具有扫描系统 逐点扫描成像 4.激光作为光源5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物,Fluorescent Microscope,Objective,Arc Lamp,Emission Filter,Excitation Diaphragm,Ocular,Excitation Filter,Objec
2、tive,Laser,Pinhole,Excitation Pinhole,PMT,EmissionFilter,Excitation Filter,Confocal Microscope,人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm,电子显微镜的缺点：1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难.2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象荧光显微镜的缺点:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采集2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。4.无法对样品进行断层扫
3、描,完成3D的工作.5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度.6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠,激光共聚焦显微镜的应用,单、双、三,四色标记检测。精确的一、二、三、四维观察。高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。静态和动态观察(CA2+,pH,膜电位,膜流动性等)。定性以及定量分析。光谱扫描,ROI扫描.特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。,时间分辨和快速扫描动态图像,出色的反射光图像,明场，DIC,相差和透射光图像,单标，双标和三标图像,激光共聚焦显微成像技术的应用,一.定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量 如：
4、细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与 共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI 末端原位杂交-fitc+PI荧光原位杂交：染色体基因定位单细胞凝胶电泳GFP的表达活细胞或活体组织静息游离Ca2+的分布与定量活细胞内pH的定量、膜电位的测量活细胞内自由基水平的定量,Helagreen-中心体red-纺锤体,Immuno-fluorecence label,二.光学切片和三维重组光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学
5、观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。,显微CT与三维重组,3D reconstruction,三.动态测量游离Ca2+,Mg2+、K+、Na+测量pH值的检测,自由基的检测,相对 测量程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测量 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG),四.细胞膜电位的测量标记膜电位探针(慢反应）：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3)548nm 573nmDioc6(3)484nm 500nm快反应探针：Di-4-ANEPPS 496nm 703nmDi-4-ANEPPS 498nm
6、713nm细胞膜静息膜电位：-70mV线粒体膜电位：-150mV以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针,FRAP(Fluorescence recovery after photobleaching)原理,Intense laser BeamBleaches Fluorescence,Recovery of fluorescence,10 seconds,30 seconds,Zero time,Time,%F,五.荧光漂白恢复(FRAP:Fluorescence Recover after photobleaching）,荧光光漂白后的回复：FRAP生物膜脂质分子的侧向
7、扩散；胞间通讯的研究；胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。,六荧光能量共振转移(fluorescence Resonance Energy Transfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。荧光能量共振转移的条件两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm供体的发射波长与受体的激发波长一致,荧光共振能量转移（FRET）技术 生物大分子结构和功能研究 免疫分析 核酸杂交分析 蛋白质间相互作用研究r:分子间距离 R0:分子间发生50%能
8、量转移的距离,检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。应用：检测大分子的相互作用 大分子构象的改变(蛋白)例：大分子(亚基)的结合与分离 受体与配体的结合 常用荧光探剂：FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP,曲霉营养菌丝横隔,不同霉菌自发荧光成像，示普通光学显微镜下不曾观察到的现象,微生物自发荧光Confocal成像,植物学应用:植物细胞中的微管列阵(microtubule array),周质微管,早前期微管带,纺锤体,成膜体,农业的应用:植物细胞中的微
9、丝分布,烟草悬浮培养细胞中的微丝网络,农业的应用:花粉萌发过程中微丝骨架的变化,农业的应用:Jasplakinolide解聚微丝的实时观察,Zaslavskaia et.al,Martek Biosciences,MD,June 15,2001,November 2001;Volume 128(21):pp 4301-4314.Courtesy:Jose-Eduardo Gomes,University of Oregon,USA,Nature,25 April 2002,pg 854,GFP-MAP4融合蛋白表达显示微管骨架（美国Cyr实验室）,奶山羊发育中乳腺上皮细胞主要细胞器的变化,为研
10、究奶山羊乳腺的胚后形态发育，采用活细胞荧光标记法结合激光共聚焦显微技术，观察奶山羊乳腺发育中主要细胞器的变化。根据奶山羊乳腺发育特点，采样时点分为：妊娠期 1 月、3 月、5 月；泌乳期 10 日、30、60 日、120 日；退化期 3 日、7 日、21 日，共计 10 个时点。,主要试剂及耗材 DMSO 购自 Sigma 公司；优质胎牛血清（FBS）、DF12 培养基、I型胶原酶均购自 Gibco公司；内质网荧光探针（E-34251，激发/发射波长为 504/511nm）、线粒体荧光探针（M-7512，激发/发射波长为 579/599nm）、Hochest 33258 均购自 Invitro
11、gen公司。Confocal 专用细胞培养皿购自北京博蕾德科技公司。,奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养 无菌切取 13g 乳腺组织，胶原酶消化法进行乳腺上皮细胞的分离培养。对胶原酶浓度及消化时间进行优化，确定最适酶浓度为 400U/ml，消化时间为 3.5 小时。以 1x106个/ml的密度铺于 Confocal 专用细胞培养皿中，置于 5CO2、37恒温培养箱中培养，并观察细胞生长情况。23 天更换培养液，观察细胞生长约 8090汇合度时，进行细胞器荧光检测。,乳腺上皮细胞主要细胞器的检测 37预热、终浓度为50nmol/L的M-7512工作液，37染色40min；37预热、终浓度为 1mol/L 的 E-34251 工作液，37染色 30min10g/ml 的 Hochest 33258 复染 5min图像采集与数据处理 激光扫描共聚焦显微镜使用三通道（PMT）检测。激发谱线：405nm（激发 Hochest 33258 标记的蓝色荧光，染核 488nm（激发 E-34251 标记的绿色荧光，染内质网）543 nm（激发 M-7512 标记的红色荧光，染线粒体）。扫描模式为 xyz，以0.4m 的 Z 轴步距逐层扫描，点平均 2 次，面平均 4 次，三个通道序列扫描成像，overlay 处理后采图保存。,
