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1、第七章 微生物的生长繁殖及其控制第一节 微生物生长繁殖及其测定一、 微生物生长繁殖l 个体生长：原生质总量增加，个体增大l 繁殖：个体数目增加l 群体生长：个体生长个体繁殖代谢产物增多二、纯培养的分离方法 l 纯培养：在实验条件下从一个细胞繁殖得到纯种群体l 分离原理：稀释样品，使各种细胞分开，再培养，使单个细胞生长繁殖成单菌落.挑取单菌落，再在平板上加以35次划线纯化。l 稀释混合倒平板法l 涂布法 l 划线法 l 单细胞挑取法：用显微挑取器 l 选择培养基分离法 l 其它分离方法:产孢菌分离：可先加热，杀死营养细胞，再分离病原微生物分离：选取敏感组织细胞数量少样品分离：先富集培养或浓缩样品
2、三、微生物生长的测定（一）测生长量1 直接法：称重量法：离心沉降物干重测体积法：离心沉降物体积2 间接法比浊法：分光光度计，450650nm波长生理指标法：含氮量；核酸；好氧量等（二）计繁殖数1 直接法：计数板计数法（如血球计数板）2 间接法：平板菌落计数法为活菌计数法把菌液稀释后，取一定量混合倒平板或涂布平板，培养后，每一个活细胞就形成一个菌落，此即菌落形成单位（colony forming unit,cfu）。根据每皿上cfu数推算出样品含活菌数稀释倒平皿菌落计数法:第二节 微生物的生长规律一、同步生长(synchronous growth)使培养基中细菌同时分裂，处于相同的生长阶段叫同步
3、生长。获得同步生长(synchronous growth)的方法：诱导法：如芽孢诱导萌发、藻类光照控制机械选择法过滤法离心法二、单细胞微生物的典型生长曲线生长曲线（growth curve）:定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的曲线单细胞微生物的典型生长曲线：把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，以细胞数目的对数对时间作图所得曲线。根据生长速率不同可分为延滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期单细胞微生物典型生长曲线:（一） 延滞期(lag phase)1 延滞期特点l 净生长等于零或略有下降l 菌体粗大l 含量增加l 代谢活力强l 对不良条件抵抗能力降低2 延滞期
4、出现原因l 适应新环境；需要合成多种酶，尤其是胞外酶；DNA复制l 影响延滞期限长短因素接种龄接种量培养基成分4 生产上：缩短延滞期可以缩短生产周期，提高设备利用率。l 接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄 l 加大接种量。一般10l 用与培养菌种接近的组分的培养基（二） 指数期(对数期)(exponential phase)1 特点l 活菌数和总菌数接近 l 酶系活跃，代谢旺盛l 生长速率最大，代时（generation time）最短l 细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致生产上：多利用做该期的细菌种子和科学试验材料 2 出现原因l 细胞适应了新环境，开始大量分裂l 营养充足l pH值EH
5、值等理化条件适宜l 有害代谢产物少（三） 稳定期(stationary phase)1 稳定期特点l 活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。l 细菌次级代谢物和代谢副产物大量积累l 芽孢杆菌这时开始形成芽孢l 稳定期中后期是生产收获时期：需要菌体在中期收获；需要发酵产物，尽量延长此期2 出现原因l 营养的消耗l 营养物比例失调l 有害代谢产物积累l pH值、EH值、温度等理化条件变化3 生产上：延长稳定期l 补料：补充营养l 在线调节pH值、EH值等理化条件l 取走产物l 以上方法连续在线进行连续培养（四） 衰亡期(decline phase/death phase)1 特点l 细菌死亡数大于
6、增殖数,活菌数明显减少,群体衰落 l 细胞出现多形态,大小不等的畸形,变成衰退型 l 细胞死亡,出现自溶现象2 生产上：避免衰亡期 要连续监测发酵情况，最好在稳定期中后期停止发酵，避免进入衰亡期。一可缩短周期，二可避免细胞溶解物造成产物提取困难三、分批培养（batch culture)和连续培养(continuous culture)（一）分批培养： 将微生物置于一定容积的培养基中培养，最后一次收获 （二）连续培养：将微生物放在恒定容积的流动系统中培养，连续添加培养基，并以相同速度取走培养物优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质量均一 缺点：菌种易退化；易染杂菌第三节 影响微生物生长的主要因
7、素l 物理因素：温度、湿度、渗透压、射线、超声波l 化学因素：营养条件、O2、pH值、化学药物l 生物因素：在混杂群体中受其它微生物影响一、温度 l 最适生长温度和最适发酵温度往往不一致 l 低于最低生长温度时停止生长：低温菌种保藏l 高于最高耐受温度时死亡：酶失活，高温杀菌根据最适生长温度（optimum growth temperature）分类实验室培养中温微生物常用温度：l 细菌：37 l 放线菌、酵母菌： 28 l 霉菌：26 l低温对微生物的影响：酶活力下降，代谢下降，繁殖停止，进入休眠菌种低温保藏：l 冷藏：4，冰箱l 冻藏：20 ，冰箱l 超低温： 80 ，超低温冰箱u 196
8、 ，液氮，液氮罐二、pH值 l 影响酶活性l 影响细胞膜透性与稳定性 l 影响物质溶解度 l 影响细胞表面电荷分布 l 最适生长pH值与最适发酵pH值往往不一致l 微生物的活动也能改变环境中的pH值l 低酸保存食物：酸菜根据氢离子浓度对微生物分类 嗜酸微生物嗜碱微生物耐酸及耐碱微生物三、溶解氧（O2）l 好氧菌（obligate or strict aerobes）l 厌氧菌（anaerobes） l 兼性厌氧菌（facultative anaerobes） l 微好氧菌（microaerophilic bacteria）l 耐氧菌（aerotolerant anaerobes） l 微生物与
9、氧的关系第四节 有害微生物的控制一、几个概念灭菌（sterilition）：杀死物体上全部微生物的方法消毒(disinfection)：杀死或消除物体上的病原微生物的方法防腐(antisepsis)：用理化方法防止/抑制微生物生长的方法化疗(chemotherapy)：利用对病源菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖 二、控制微生物的物理因素(一)高温灭菌l 多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65 10 min可以致死。l 一般噬菌体6580 致死， l 放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，7680 10min可以杀死 l 细菌芽孢，在121 下
10、515min才能致死高温灭菌l 湿热灭菌(mosist heat sterilization) l 干热灭菌(dry heat sterilization) l 焚烧灭菌法：常用于废弃物动物尸体等处理l 烘烤灭菌法：实验室用干燥箱烘烤金属、玻璃器皿，170 2h1 湿热灭菌(most heat sterilization) 该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的情况下容易凝固，如含水50，蛋白质凝固温度为56；含水6蛋白质凝固温度为160-170l 煮沸灭菌法（煮沸消毒法） l 高压蒸汽灭菌法l 间歇灭菌法l 巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）煮沸灭菌法（煮沸消毒法）： 物品在水中煮沸 15min
11、，可杀死所有营养细胞和一部分芽孢。高压蒸汽灭菌(normal autoclving)：l 是湿热灭中最好方法，通常在1.05kg/cm2的压力下面（此时温度121）处理1530min。l 要排冷空气，否则会形成假压，虽然压力达到要求，温度却达不到相应高度，而影响灭菌效果（二）紫外线不能穿透2mm的玻璃，常用于空气和表面灭菌杀菌机制： 诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制 紫外线 O（三）高渗作用l 高盐/高糖保藏食品l 等渗溶液对微生物生长有利l 细菌处于低渗液中会吸水膨胀乃至破裂l 细胞处于高渗液中会脱水引起质壁分离l 和蛋白质变性，导致死亡 l 耐低不耐高（三）干燥l 干燥使蛋
12、白质变性、酶活力下降、盐浓度上升，代谢下降甚至细胞死亡l 干燥保藏菌种、食品（四）超声波超声波破碎细胞，用于细胞内容物提取二、控制微生物的化学物质(因素)l 表面消毒剂l 溶液状态l 气体状态l 化学治疗剂l 抗代谢物l 抗生素l 生物药物素（一）表面消毒剂(surface disinfactant)酸和碱 重金属极其盐类有机化合物 氧化剂 卤素 染色剂表面活性剂 1 酸和碱 微生物细胞中的DNA，RNA，E只有在中性条件下才能体现活性， 因此强酸碱具杀菌作用。医院病房常用乙酸消毒。2 重金属极其盐类是杀菌剂和防腐剂，作用最强的是Hg,Ag,Cu,作用机理：使蛋白质变性，使酶失活。（与E的SH
13、结合。）00202HgCl2（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用。 011AgNO3 可消毒皮肤另外还有砷，铋、锑的化合物是治疗梅毒的特效药3 有机化合物醇、醛、酚是常用的杀菌剂l 杀菌机制 l 损伤细胞壁 l 使蛋白质变性（细胞膜，E失活） l 抑制脱氢酶，氧化酶活性l 甲醛：纯甲醛为气体，3740水液为福尔马林l 醇是脱水剂和蛋白质变性剂,70乙醇杀菌效果最好 l 酚：35的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌，甲酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液 4 氧化剂K2MnO4使菌体蛋白质氧化，使酶失活。 013浓度可用于皮肤，果品、餐具、消毒。H2O2清洗伤口。 5 卤素 氯，碘是常用
14、的消毒剂 碘杀菌力强，37碘溶于7083的乙醇中成碘酒。 氯及氯化物常用于水及食品消毒与水结合放出原子氧（O）用于消毒。6 染色剂如紫药水为结晶紫的乙醇溶液l 干扰菌体氧化还原电位 l 阻碍芽孢的形成。 7 表面活性剂具有降低表面张力效应的物质叫表面活性剂。常用的有新吉尔灭，去污剂，肥皂、洗涤剂等。表面张力降低可抑菌或杀菌（二） 抗代谢物(antimetabolite)有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能。干扰代谢的正常代谢。这些物质称为抗代谢物。（三） 抗生素(antibiotic) 是由微生物产生（有的可人工合成）具有抑制或杀死其他微生
15、物作用的有机化合物每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱神奇的抗生素 l 抑制细胞壁的形成：青霉素l 干扰蛋白质合成：链霉素、金霉素、土霉素、四环素l 抑制核酸复制：增光霉素、丝裂霉素、放线菌素Dl 影响细胞膜的功能:多粘菌素破坏 G-细胞膜；制霉菌素破坏真菌细胞膜（四） 生物药物素(biopharmaceutin)具有多种生理活性的比抗生素疗效更为广泛的微生物次生代谢产物l 酶抑制剂l 免疫调节剂l 受体拮抗剂l 抗氧化剂附：抗药性(antibiotic resistance)l 菌体内产生了钝化l 或分解药物的酶l 改变细胞膜的透l 性而导致抗药性l 泵出机制l 细胞内被药物作用的部位发
16、生了改变，目前典型的例子是核糖体发生了改变。 抗生素 核糖体结合 蛋白质不能合成应对抗药性：l 第一次用药剂量要足 l 避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素 l 不同抗生素（或其他药物）混合使用 l 对现有抗生素改造 l 筛选新抗生素 思考题1 名词解释：灭菌、消毒、分批培养、连续培养、效应巴斯德、代时、微生物生长、耐氧菌、巴氏消毒法、间歇灭菌法、抗生素、防腐、2 试述主要灭菌方法及其原理、优缺点、应用范围3 试述微生物液体培养过程中pH值变化原因及控制措施 4 兼性厌氧微生物为什么在有氧和厌氧条件下都能生长5 试举例说明抗生素杀菌机理6 试述稀释倒平皿菌落计数法的原理并图示操作步骤7 什么叫生长曲线？图示并说明单细胞微生物典型生长曲线的特点、成因及其对发酵生产的指导作用8 利用酒精酵母液体发酵生产乙醇，是否要求整个过程通气？是否采用相同pH值和温度？为什么？9 从196到170 ，与微生物学工作关系密切的温度（范围），有哪些？(提示：生长、抑制、杀灭、菌种保藏)
