第一部分生物化学技术概论.docx

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1、第一部分 生物化学技术概论本部分内容为生物化学实验中所涉及的主要技术原理、实验记录和实验报告的书写，介绍如何正确记录实验过程及书写实验报告的一般规则，是训练学生进行正规实验操作的重要内容。普通实验技术包括玻璃仪器的洗涤、洗液的配制、吸量管的使用、样品的混匀以及过滤、离心等一般实验室技术。实验样品的制备着重讨论在生物化学实验中，血液、尿液、样品及组织材料的采集和处理，匀浆制备和组织浸出液制备。离心分离技术、电泳原理、分光分析、层析分析和放射性同位素技术，重点讨论这些重要技术的原理，内容则尽可能简洁扼要，作为具体实验内容的参考。1 实验记录和实验报告的书写实验是在理论指导下的科学实践，目的在于经过

2、实践，掌握科学观察的基本方法和技能，培养学生的科学思维、分析判断和解决实际问题的能力，也是培养探求真知、尊重科学事实和真理的学风，以及培养科学态度的重要环节。为此，要求学生在实验之前必须预习、理解基本原理和实验基本操作步骤、注意事项，列出所需试剂和仪器，实验中组织安排好时间，严肃认真地进行操作，细致观察变化，如实作好记录、书写实验报告等。一、实验记录1. 实验记录要整洁、字迹清楚。2. 实验中观察到的现象、结果和数据，要及时地直接记在记录本上，原始记录必须准确简练、详尽、清楚。3. 记录时，应做到如实正确记录实验结果，不可夹杂主观因素。在实验条件下观察到的现象，也应如实仔细地记录下来。在定量实

3、验中观察到的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、分光光度计的光密度值等，都应设计一定的表格准确记录，并应根据仪器的精确度准确记录有效数字。要求对实验的每个结果都应准确无遗漏地做好记录。4. 实验中使用仪器的类型、试剂的规格、化学反应式、分子量、浓度等，都应记录清楚。5. 实验过程中，应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。6. 完整的实验记录应包括日期、实验题目、目的、操作、结果等。二、实验报告1. 实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，写出实验报告。2. 实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、原理、试剂配制、仪器设备、操作方法、实验结果、讨论等项内容。3. 书写实验报告时，目的和要求

4、、原理以及操作方法部分应作简单扼要的叙述，但对实验条件和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验的要求，把所得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如标准曲线图以及实验组与对照组实验结果的比较表。还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分不是对结果的重述，而是对实验方法、实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。4.一般实验，要有结论，结论要简单扼要，说明本次实验所获得的结果。2 普通实验技术一、玻璃仪器的洗涤与清洁玻璃仪器是生物化学实验中不可缺少的器具，玻璃仪器的清洁与否，直接影响实验效果的准确性。因此，玻璃仪器的清洁

5、工作是很重要的。（一）新购玻璃仪器的清洗 新购来的玻璃仪器，其表面附有游离碱质，可先用肥皂水洗刷，再用流水冲洗,浸泡于12 HCl中过夜，再用流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗23次，在干燥箱中烤干或晾干备用。（二）使用过的玻璃仪器清洗1. 一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷蘸取洗衣粉或肥皂水，将器皿内、外壁细心刷洗，再用自来水冲洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗23次，倒置在清洁处晾干，急用时可用干燥箱烤干。2. 容量仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，使用后应立即浸泡于清水中，勿使玷污物质干涸，并及时用流水冲洗干净，稍干后再用铬酸洗液

6、浸泡数小时，然后用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗23次，晾干备用。3. 比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗干净。如洗不净时，可用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗干净。切忌用试管刷、粗糙的布或纸擦洗，以免损坏比色杯透光度，亦应避免用较强的碱液或强氧化剂清洗，洗净后，倒置晾干备用。二、清洗液的原理和配制（一）肥皂水、洗衣粉溶液和去污粉，是最常用的洗涤剂，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白质及其它粘着性物质溶解或松弛，一般玻璃仪器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。（二）铬酸洗液1. 原理：铬酸洗液由重铬酸钾（或重铬酸钠）和浓硫酸配制而成，其清洁效力主要应用其强氧化性和强酸性。铬酐越多，硫酸越浓，其

7、清洁效力也就越强，当洗液变绿色后则不宜应用。K2Cr2O7H2SO4 H2Cr2O7K2SO42CrO3铬酐（红色）H2OCr2O3(绿色)3(O)H2SO4 H2OSO2(O) 2. 配制：称取重铬酸钾5g放于250ml烧杯中，加热水5ml搅拌，使其尽量溶解，烧杯下垫一石棉网以防过热，然后慢慢加入工业用浓硫酸100ml，随加随搅拌，尽量避免红色铬酐沉淀析出。此时溶液由红黄色变成黑褐色。冷却后，储于指定容器内盖紧以防吸水。3. 使用：应用洗液前必须将玻璃仪器用自来水冲洗数次，并将仪器上的水分尽量除去，再放入洗液中浸泡，数小时后取出仪器，用自来水充分冲洗至无洗液为止（冲洗时注意勿将洗液溅出水槽）

8、，再用少量蒸馏水冲洗数次，晾干备用。上述两种洗涤液是最常用的，实验中遇到一些特殊污物，需用针对性强的洗涤液。（三）磷酸三钠洗液 为5 Na3PO412H2O水溶液，此液为碱性，可洗涤油污物，但所洗的仪器不适于作磷的测定。（四）乙二胺四乙酸二钠洗液（EDTA洗液） 为5 %10 的EDTA洗液，加热煮沸可洗脱玻璃内壁的钙镁盐类白色沉淀和不易溶解的重金属盐类。（五）尿素洗液 为45 尿素水溶液，用来洗血污，为蛋白质的最好溶剂。（六）草酸洗涤液 可洗脱高锰酸钾的痕迹，用时加少量硫酸效果更好。（七）盐酸酒精洗液 3 盐酸酒精液，可除去玻璃器皿上的染料附着物。三、吸量管的种类和使用吸量管是生化实验中常用

9、的仪器，测定的准确度与吸量管的正确使用密切相关。（一）分类 生化实验常用的吸量管有三类（图1）：1.奥氏吸量管：供准确量取0.5ml、1ml、2ml液体时使用。每根吸量管上只有一个刻度，放液时必须吹出最后残留在吸量管尖端的液体。2.移液管：供准确量取5ml、10ml、20ml等较多体积液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放出液体流毕后，将吸量管尖在容器内壁上继续停留15秒，注意不要吹出尖端内的最后部分。3.刻度吸量管：供量取10ml以下的任意体积的液体时用。每根吸量管上都有许多等分刻度，一般刻度包括尖端部分，欲将所量取液体全部放出时，须将残留管尖的液体吹出。刻度吸量管的规格通常有0.1、0.2

10、、0.5、1、2、5、10ml等7种。1 2 3 4图1 三类吸量管简图1，2 刻度吸量管 3 奥氏吸量管 4 移液管 （二）吸量管的使用1.选择：使用前先根据需要选择适当的吸量管，刻度吸量管的总容量最好等于或稍大于最大取液量。临用前要看清总容量和刻度。2.执管：用拇指和中指（辅以无名指），拿住吸量管上部，用食指堵住管上口和控制液流。刻度数字要朝向自己。3.取液：另一只手捏压橡皮球，将吸量管插入液体内（不得悬空，以免液体吸入球内），用橡皮球将液体吸至最高刻度上端12cm处，然后迅速用食指按紧吸量管上口，以免液体从吸量管下口流出。4.调准刻度：将吸量管提出液面，吸粘性较大的液体时，先用滤纸擦干管

11、尖外壁；然后用食指控制液体使之缓慢下降，当至所需刻度时，立即按紧吸量管上口（此时液体凹面、视线和刻度应在同一水平面上）。5.放液：放松食指，让液体自然流入容器内，放液时，管尖最好接触容器内壁，但不要插入容器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。6.洗涤：吸取血液、血清等粘稠液体及尿液标本的吸量管，使用后要及时用自来水冲洗干净；吸一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，实验完毕后再冲洗。冲洗干净后，晾干，再浸泡于铬酸洗液中，数小时后取出，再用流水冲净，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。四、溶液的混匀样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地互相接触，必须借助于外加的机械作

12、用。混匀时须防止容器内液体溅出或被污染。严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振摇。混匀的方式大致有以下几种，可随使用的器皿和液体容量而选用。（一）旋转混匀法 用手持容器，使溶液作离心旋转，适用于未盛满液体的试管或小口器皿，如锥形瓶。旋转试管时最好用手腕旋转。（二）指弹混匀法 左手持试管上端，用右手指轻轻弹动试管下部，使管内溶液作旋涡运动。（三）倒转混匀法 适用于有塞量筒和容量瓶、试管内容物的混匀。一般试管内容物的混匀可用聚乙烯等薄膜封口，再用手按住管口倒转混匀。（四）吸管混匀法 用吸量管将溶液反复吸放数次，使溶液充分混匀。（五）玻棒搅动法 适用于烧杯内容物的混匀，如固体试剂的溶解和混匀。（六）甩

13、动混匀法 右手持试管上部，轻轻甩动振摇，即可混匀。（七）电磁搅拌混匀法 在电磁搅拌机上放置烧杯，在烧杯内放入封闭于玻璃或塑料管中的小铁棒，利用磁力使小铁棒旋转以达到混匀杯中液体的目的，适用于酸碱自动滴定，pH梯度滴定等。（八）振荡器混匀法 利用振荡器使容器中的内容物振荡，达到混匀的目的。五、过滤是分离沉淀和滤液的一种方法，可用于收集滤液，收集或洗涤沉淀。生化实验的过滤，操作与化学实验中的操作相同，应注意以下几点：（一）制备血滤液等实验过滤时，要用干滤纸而不能用水把滤纸弄湿，因为湿滤纸会影响血液稀释的体积。（二）折叠滤纸与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。一般采用平折法（即对折后再对折）。（三）向漏斗中

14、加溶液时最好使用玻棒引流，倒入速度不要太快，不得使液面超过滤纸上缘。（四）组织匀浆等较粗样品的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸，有时可用离心沉淀法代替过滤法。六、离心机的使用方法欲使沉淀与溶液分开，过滤和离心都可达到目的，但当沉淀粘稠、颗粒太小且能通过滤纸或总容量太少又需定量测定时，使用离心沉淀法优于过滤法。使用离心机前，应检查离心机转动状态是否平稳，以确定离心机的性能；检查套管与离心管大小是否相配，套管是否铺好软垫（用棉药或橡皮），检查套管底部应无碎玻璃片或漏缝。检查合格后，将一对离心管放入一对套管中，然后连套管一起分置粗天平两侧，用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止

15、。将各对平衡的套管连同内容物放置于离心机内，两个等重的离心管必须放于对称位置。放妥后，接通电源开关，逐步扭动转速旋钮，缓慢增加离心机转速，直到所需的转速。达规定时间后，将转速旋钮逐步调回零，待离心机停稳后，取出离心管。3 实验样品的制备在生物化学实验中，无论是分析组织中各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，都需要利用预先处理过的特定生物样品。掌握实验样品的正确处理与制备方法是做好生物化学实验的先决条件。在基础生物化学实验中，最常用的实验样品是人或动物的血、尿和组织等。血样品常采用全血、血浆、血清或无蛋白血滤液。组织样品则常用动物的肝、肾、胰、胃粘膜或肌肉等组织。现将这些样品的制备方法扼

16、要介绍如下：一、 血液样品收集动物或人的血液时应使用清洁干燥的试管或器皿，以防止溶血。（一）全血 取出血液后，迅速置于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻混匀，使血液和抗凝剂充分混合，以免血液凝固。取得的全血如不能立即进行实验，应储存于冰箱中。 常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠等，根据实验的要求而定，一般情况下使用肝素钠或肝素。抗凝剂的用量不宜过多，以免影响实验结果。通常每毫升血液加草酸盐12mg，柠檬酸钠5mg或氟化钠510mg，肝素仅需要0.010.2mg。可将抗凝剂配成适当浓度的水溶液，按需要量加到准备盛血的试管中，并涂布于试管壁，横放烘干（肝素不宜超过30）备用。 （二）血浆 将上述抗凝

17、全血在离心机中离心，血细胞下沉，上清液即为血浆。分离血浆时，必须严格防止溶血，除采血时一切用具（注射器、针头、试管等）都需要清洁干燥外，取出之血液也不能剧烈振摇。 （三）血清 收集的血液若不加抗凝剂，在室温下约510分钟即自行凝固。血液凝固3060分钟后，即可采用离心方式分离出血清。若血块粘附于容器壁过于牢固、血清不易分离出来时，可用细玻璃棒轻轻剥离血块。（四）无蛋白血滤液 分析血液中某些成分时（如血液中的非蛋白氮、葡萄糖、肌酸等）为了避免蛋白质的干扰，需预先除去血中的蛋白质成分。常用三氯醋酸，钨酸等沉淀剂与蛋白质作用，然后用过滤或离心方法制备无蛋白血滤液。二、尿液样品 一般定性实验可以用随时

18、收集的新鲜尿液。定量测定尿液中各种成分时，应把收集的24小时的尿液混合后再取样。因为一天之中各次排出尿液的成分，随食物、饮水及一昼夜体内生理变化等的影响而有很大的差异。 收集尿液的方法一般在早晨一定的时间先排弃残余尿，再将每次尿均收集于清洁大玻璃瓶中，到第二天早晨同一时间收集最后一次尿液即可。把收集24小时尿液充分混合后用量筒量准其总体积，然后取样分析。 收集的尿液如不能立即进行实验，应置于冷处保存。必要时可在收集尿液的瓶中预先放入防腐剂，通常每升尿中约加入甲苯10ml或浓盐酸10ml。收集实验动物的尿液时，可将动物置于代谢笼中，按以上方法通过笼下的漏斗收集动物24小时的尿液。 三、组织样品在

19、生物化学实验中，常常利用离体组织研究各种物质代谢的途径与酶系的作用，也可以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但是生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。因此，利用离体组织作为提取材料或代谢研究材料时，应在冰冷条件下迅速取出所需组织，并尽快进行提取或测定。 一般采用断头法（或注射空气于动物心脏）处死动物，放出血液，立即取出实验所需之脏器或组织，去除外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液，必要时也可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液，再用滤纸吸干。迅速称重后，根据实验的不同要求，用以下不同的方法制成不同的组织样品。 （一）组织糜 将组织用剪刀迅速剪碎，或用绞肉机绞成

20、糜状即可。 （二）组织匀浆 向剪碎的新鲜组织中加入适量冰冷的匀浆制备液，用高速电动匀浆器或玻璃匀浆器制成匀浆。常用的玻璃匀浆器有5ml和10ml两种，由一个磨砂玻璃套管和一个带有磨砂玻璃杵头的杵组成。玻璃杵的外壁必须紧靠玻璃套管的内壁。用时将套管放入冰浴中，玻璃杵与调速马达连接，将剪碎的组织悬浮于匀浆制备液中并倾入套管中，然后再把玻璃杵插入套管中。开动马达并调节杵的转速，小心地用手扶住套管口部，不断上下移动，直至组织碎块磨成匀浆为止。 常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液或0.25mol/L蔗糖溶液等，可根据实验的不同要求，加以选择。 （三）组织浸出液 将上法制成的组织匀浆进行离心，其上清液即为

21、组织浸出液。4 离心分离技术原理 离心机是利用离心力把溶液中的粒子进行分离的一种仪器。所谓离心力是指物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运动中心的力。 离心力的单位为g即重力加速度（980.6cm/s2），离心力的大小可根据离心时的旋转速度V（r/min，每分钟转数，revolution per minute）和物体离旋转轴中心的距离r（cm ）按下式计算： g = r V2 1.118 10-5或按下式计算所需的转速V=（g89445）/r在离心场中物体所受离心力的大小，与物体离旋转轴中心的距离有关，离轴心越远，所受到的离心力越大。计算时通常采用平均距离。 根据离心机转速的不同，常将离

22、心机分为普通离心机（最高转速4 000 r/min）、高速离心机（最高转速20 000r/min）和超高速离心机（最高转速60 000r/min以上）。超速离心机又可分为分析超速离心机和制备超速离心机两类，前者能精确控制离心力，并且可用照相方法或者电子技术记录沉降粒子在离心过程中的行为，对这些记录进行分析，可以测定粒子的物理性质，如沉降系数、分子量、扩散系数、沉降物质的不均一性等。 制备离心技术包括两种方法：一种是分级离心法，另一种是密度梯度离心法。 一、分级离心法非均一的粒子悬浮液在离心机中离心时，各种粒子以各自的沉降速度移向离心管底部，逐步在底部形成一层沉淀物质。这层沉淀物质含有各种组分，

23、但是最多的是那些沉降得最快的组分（图2）。为了分出某一特定组分，需要进行一系列离心。通常先选择一个离心速度和离心时间，进行第一次离心，把大部分不需要的大粒子沉降去掉，这时所需要的组分大部分仍留在上清液内；然后将收集到的上清液用更高的转速离心，把需要的粒子沉积下来。离心时间要选择得当，使大部分不需要的小粒子仍留在上清液中。经过较高速度离心后，倾去上清液，把沉淀悬浮起来，再用较低转速离心。如此反复高速、低速离心，直至达到所需粒子的纯度为止。这种基于粒子沉降速度不同而分离的方法，用得非常普遍，对病毒和亚细胞组分的浓缩特别有用；但是要得到一个纯组分较困难，即使沉降最慢的组分较纯，它的收得率也是很低的。

24、1 2 3 4图2 分级离心法 二、密度梯度离心法 密度梯度离心法较分级离心法复杂，但是具有很好的分辨能力。密度梯度离心可以同时使样品中几个或全部组分分离，这是分级离心法所不及的。这个方法是把样品粒子在一个密度梯度介质中离心，这个介质由一合适的可使小分子和样品粒子在其中悬浮的溶剂组成。离心时，离轴心愈远介质密度愈大。密度梯度离心法又可分为两种操作方法：速率区带离心技术和等比重技术，两者的原理是不同的。（一）速率区带技术 用速率区带技术分离样品依赖于样品中粒子或高分子的大小和沉降速度的不同。如图3所示，把一层样品溶液铺于一种密度梯度介质液柱的顶部，样品在液柱顶部形成一个负梯度，不过底部存在着一个

25、陡的正梯度，防止样品的过早沉降。离心力作用下粒子在梯度介质中呈分离的区带状沉降，每一条区带粒子的特征是具有同一沉降速度。根据不同的实验目的可以设计不同的梯度。要使速率区带离心得到成功，样品粒子的密度必须大于梯度液柱中任一点的密度，并且必须在区带到达离心管底部以前停止离心。以下列举了速率区带法的典型实验运转参数（表1）1 2 3 图3 在水平式转头中进行速率区带分离1.充满密度梯度溶液的离心管 2.样品加于梯度顶部 3.离心力作用下粒子按照它们的质量以不同的速度移动 表1 速率区带法的典型实验和运转参数样 品 沉降系数 转头 * 蔗糖梯度 转 速 时 间 温度 （S） （%W/W） （r/min

26、） （小时） （）血清 4，7 SW60 520 60 000 5 5血清 4，7，19 SW60 1040 60 000 16 5多核糖体（鼠肝） 80以上 SW50.1 1050 50 000 1.5 5核糖体亚单位 30，50 SW50.1 1040 50 000 3 5血清 4，7 SW50.1 1020 50 000 14 5血清 4，7 SW50.1 35 50 000 6 5酶（大部分） 2.54.5 SW60 1040 60 000 18 5亚细胞组分（无线粒体） SW27 25/35 27 000 3 5核糖体RNA（鼠肝） 18.28 SW50.1 520 50 000 5

27、 5核糖体RNA（鼠肝） 18.28 SW60 1040 60 000 4.5 5DNA（大部分） 22 SW60 碱性1040 55 000 5 5*Beckman离心机的转头型号，以SW50 .1为例，SW是水平式转头，50表示最高转速为5 000，最后数字1是型号。SW40/41是二种水平转头，最高转速分别为40 000 r/min和41 000 r/min。（二）等比重技术 等比重技术是按粒子浮力密度分离的方法。选择介质的密度梯度，要使其梯度的密度范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以铺在密度梯度液柱上面或均匀分布于密度梯度介质中。离心过程中粒子移至与它本身相同密度的地方形成区带。因此

28、平衡时，它们的分离完全是由于它们之间密度的差异，和时间无关（图4）。等比重梯度实验中最常用的介质是碱金属的盐溶液，如铯盐或铷盐。实验开始时往往是一个密度均一的溶液，在离心过程中自动形成梯度。这个过程称作“自生梯度”。形成梯度过程中，原先均匀分布的样品粒子也下沉或上浮至其等比重位置。这种“自生梯度”技术需要长时间离心，例如，DNA在氯化铯梯度中形成等比重区带需要36到48小时。特别要指出的是，离心时间不会因转速增加而减少，提高转速只能使梯度物质重新分布，区带位置有所改变。许多密度梯度实验常常把速率区带方法和等比重法合并应用。例如选择一个密度梯度使得样品中一部分组分沉降到离心管底部，而另一部分组分

29、停留在它的等比重区。1 2 图4 “自生”梯度等比重分离1.样品与梯度物质混合物的均匀溶液 2.离心力作用下，梯度物质重新分布，样品区带保留在等比重处 5 电泳原理一、电泳的基本原理带电荷的粒子在一定条件的电场作用下，可向一极移动，如带正电荷的粒子移向负极，带负电荷的粒子移向正极，这种现象称为电泳。许多生物分子都带有电荷（如蛋白质、核酸等），其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH和组成，由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。设一带电分子在电场所

30、受的力为F，F的大小取决于质点所带电荷Q和电场强度X，即 F = QX根据Stoke氏定律，一球形的分子运动时所受的阻力F与分子运动的速度V、分子的半径r、介质的粘度的关系为： F= 6rV当F=F即达到动态平衡时：QX = 6rV 移项得：Q 6rVX= （1） VX表示带电分子在单位电场强度下的运动速度，称为迁移率，也称为电泳速度，以V表示 ，即：VXV =Q 6r= （2）由式（2）可见，一个带电分子的迁移率不仅取决于其本身所带的电荷，而且还与电场强度，介质的pH、离子强度、粘度、电渗等因素有关。二、影响电泳的主要因素（一）电泳介质的pH 当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处

31、于等电状态，即不向正极或负极移动；当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则负离子状态，移向正极。因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH8.6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。（二）缓冲液的离子强度 离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量（压缩双电层）使电泳速度减慢；所以常

32、用离子强度为0.020.2之间。 溶液离子强度的计算： I=CiZi2 I=离子强度 Ci=摩尔浓度（指离子而言） Zi2=离子的价数如：0.154mol/L氯化钠溶液离子强度为：I=（0.154120.15412）=0.1540.1mol/L硫酸锌溶液的离子强度为： I=（0.1220.122）=0.4（三）电场强度 电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米电势差计算，也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长15，两端电压（电势差）150V，则电场强度为150/15=10V/，电场强度愈高，则带电粒子移愈快。电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。（四）电渗作用

33、 在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗（图5）。如滤纸含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。电渗现象所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中间，观察电渗方向和距离。+ + + + + + + + + + + + + + + + + 支持物电渗流+ 固相液相图5 电渗示意图三、区带电泳的分类：（一）按支持物物理性状不同，可分为：1滤纸及其他纤维素膜如

34、醋酸纤维膜、玻璃纤维膜、聚酰胺纤维膜电泳。2粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。3凝胶电泳，如琼脂糖琼脂、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。4丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。（二）按支持物的装置形式不同，可分为：1平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。2垂直板式电泳。3连续-流动电泳，首先应用纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、纤维素粉或玻璃粉末代替滤纸，分离效果更好。（三）按pH的连续性不同，可分为：1连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。2非连续pH电泳：缓冲

35、液和支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可对极微量物质进行分离。四、电泳技术的应用电泳技术是目前医学研究的重要手段。它可分离各种有机物（氨基酸多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等）和无机盐。并可用于分析某种物质的纯度及分子量的测定。电泳技术和层析法结合和指纹图可用于蛋白质结构的分析；与免疫原理结合的免疫电泳，提高了对蛋白质的鉴别能力；与酶学方法结合，发现了同工酶。电泳技术是目前分离物质的一种很好方法，也是医学科学中的重要研究技术。 6 分光分析原理一、基本原理有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同

36、，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质（图6）。分光分析法常用于测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert- Beer定律。（一）Lambert定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度(C)不变则液层的厚度(L)愈大，光线强度的减弱也愈显著。若C不变： OD L （二） Beer定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，若液层的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著。若L不

37、变： OD C（三）Lambert-Beer 定律及其应用1Lambert-Beer 定律：I0IT= =10KCL当一束单色光通过一均匀溶液时，该溶液对光吸收的程度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。其关系式如下：两边取对数得：lgT=KCL I0ICL图6 一束单色光通过溶液时的情况示意图式中T为透光度，I0为入射光强度，I为透过光的强度，C为溶液的浓度，lgII0L为液层的厚度。K为常数，称为消光系数，其数值与物质种类、光线波长和溶液温度有关。 若将 用光密度（OD）表示该溶液对光线吸收的情况（有的也用吸光度A表示），则它们之间的关系如下： OD（或A）=lgT=KCLlgII02待测

38、溶液浓度的计算： 根据Lambert-Beer定律 标准溶液：ODs=KsCsLs待测溶液：ODu=KuCuLu当两种溶液的液层厚度相等（Lu = Ls）、温度相同、且波长也相同（相同物质的两种不同浓度）时，则Ku=Ks。ODsODuCsCu=两式相比得：Cu= CsODuODs即：二、721型分光光度计 这是一种采用光电管为受光器的较高级的可见光分光光度计。其波长范围为360-800nm，在410-710nm之间的灵敏度较好（图7）。使用方法如下： 1. 灵敏度选择钮放在“1”档（如调不到“OD=0” 时选用较高的档次）。2. 转动波长选择钮，选用所需的波长。3. 接通电源（指示灯亮）。4.

39、 揭开比色杯暗箱盖，转动“0电位器”使电表指针对准T=0处。5. 将比色杯放入比色杯架，使空白管对向光路，盖好比色杯暗箱盖。转动“100电位器”，调准电表指针使之指向OD=0（T=100）处。6. 拉动比色杯座的拉杆，使测定杯进入光路，迅速从电表上读出光密度值，并记录。测读过程中，随机拉回拉杆到原位，使空白杯进入光路，随时调整OD=0。7. 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，清洗比色杯并晾干。图77 层析分离原理层析法又称色谱法，色层法或层离法（chromatography），是广泛应用的一种生物化学技术。层析法有多种类型，液体作为流动相的称为液相层析，气体作为流动相的称

40、为气相层析。按层析过程的机理不同，层析法可以分为下列几种类型：（一）吸附层析 利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离。（二）分配层析 利用不同物质在流动相和固定相之间的分配系数或溶解度不同，使物质分离。（三）离子交换层析 利用不同物质对离子交换剂的亲和力不同而分离。（四）凝胶层析 利用某些凝胶对不同分子量的物质的阻滞作用不同进行分离，亦称分子筛层析。（五）亲和层析 利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。层析法采用的方式主要是柱层析和薄层层析，前者将固定相或载体装入柱内，使被分离物质沿一个方向移动而达到分离。后者将吸附剂涂布成薄层，使样品在薄层上进行分离。一、吸附层析（a

41、bsorption chromatography）氧化铝，硅胶等物质具有吸附其它一些物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同。吸附力的强弱，除与吸附剂本身的性质有关外，也与被吸附物质的性质有关。（一）柱层析法 柱层析是用一根玻璃管，管内加吸附剂粉末，用溶剂湿润后，即成为吸附柱；然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，假如样品内含两种成分A与B，则两者被吸附在柱上端，形成色圈。样品溶液全部流入吸附柱之后，加入合适的溶剂洗脱，A与B也就随着溶剂向下流动而移动，最后达到分离（图8）。在洗脱过程中，管内连续发生溶解，吸附，再溶解，再吸附的现象。假如被吸的A粒子被溶解随溶剂下移，但遇新的吸附剂，又将A吸

42、附，随后，新溶剂又使A溶解下移。由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与吸附力不完全相同，A与B移动的距离也不同。连续加入溶剂，连续分段收集洗脱液，各个成分即可顺序洗出。最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。硅胶的吸附能力和含水量关系极大，硅胶吸水后，吸附能力下降。甘油酯、磷脂、胆固醇等非极性的与极性不强的有机物，用这种方法分离效果较好。图8 二元混合物之柱层析（1）加溶剂湿润成吸附柱 （2）顶部加样品溶液（3）样品两种成分被吸附留在柱的上端 （4）加纯溶剂洗脱（5）样品中两种成分得到分离 （二）薄层层析法 薄层层析法是将吸附剂在玻璃板上均匀地铺成薄层，把要分析的样品加到薄层上，然后用合适的溶剂展开，而达到分离鉴定的目的。其优点是：设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，并可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。二、分配层析（partition chromatography）溶质在两种不相混溶的溶剂中溶解分配，是逐步达到平衡的。平衡后，溶质X在两种溶剂中的浓度取决与分配系数（a）：X在溶剂1中的浓度X在溶剂2中的浓度=a 分配层析即是利用物质在两种溶剂