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1、实验篇实验一 细胞的形态观察及其大小测量【实验目的】1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微结构；2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有一直观认识。【实验用品】普通光学显微镜;目镜测微尺;镜台测微尺;载玻片;盖玻片等。【实验材料】小白鼠肝细胞切片;鸡血红细胞;蚕豆叶片横切片;洋葱。【实验内容和方法】(一)细胞形态观察l、动物细胞的观察（1）人肝细胞切片：在显微镜下仔细观察肝细胞的形态构造。注意肝细胞之间的界限、细胞的形状、细胞核的形状和数量、核仁的形状和数量、细胞质的形态构造以及细胞质和细胞核染色的区别。（2）鸡血细胞涂片的观察：注意观察血细胞的组成；红细胞、白
2、细胞、血小板的形态特点。2、植物细胞的观察（1）取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的基本结构。（2）洋葱表皮细胞的形态观察：用镊子撕取洋葱表皮，滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片。在显微镜下观察的形态和结构。（二）细胞的大小和测量1、测微尺的使用目镜测微尺是一块圆形玻片，中心刻有一尺，长510mm，分成50100格。每格的实际长度因不同物镜的放大率和不同镜筒长度而异。镜台测微尺是在一块载玻片中央，用树胶封固一圆形的测微尺，长1mm或2mm，分成100格或200格，每格的实际长度0.01mm(10m)。当用目镜测微尺来测量细胞的大小时，必须先用镜台测微尺核实目镜测微尺每一格的长度。方法如下：(
3、1)卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。(2)将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的分度。(3)小心移动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线(如图所示)。(4)记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格等于多少m： 0123测定目镜测微尺每格实长的图解上尺：目镜测微尺；下尺：镜台测微尺镜台测微尺的格数 目镜测微尺每格的微米数= 10 目镜测微尺的格数例如，图中镜台测微尺1格=目
4、镜测微尺6格，代入公式得：目镜测微尺每格=1610m=1.66m (5)取下镜台测微尺，换上需要测量的玻片标本，用目镜测微尺测量标本。2、计算：根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积。椭球形：V=4ab23 a-长半径 b-短半径圆球形：V=43r3 r-半径圆柱形：V=r2h r-半径 h-高【作业与思考】1、血细胞分为哪几大类？分别描述你看到的不同血细胞的形态，并阐述其功能。绘图。2、任意选择你所看到的动物细胞和植物细胞各一个，绘图并进行适当标注，测量其大小，并比较动植物细胞大小的差异。3、在不同的放大倍数下，所测得的细胞大小一致吗？你认为在哪个放大倍数下测定得比较准确？为什么？实验二 P
5、AS（Periodic Acid Schiff）反应显示糖原和其它多糖物质【实验目的】1、熟悉PAS法原理及操作步骤；2、观察PAS反应的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。【实验原理】多糖(polysaccharide)是由多个单糖分子缩合脱水而生成的化合物。广泛分布于动、植物界。一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，一般称为结构多糖。另一些多糖在生物体内作为能量贮存，如淀粉（植物）和糖元（动物），在需要时可以通过生物体内酶系统的作用分解，释放出单糖。还有许多多糖具有更复杂多样的生理功能，如粘多糖、血型物质等，它们在生物体内起着重要的作用。淀粉和糖原均由D葡
6、萄糖的分支或直链组成，过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖中的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成两个游离的醛基(-GHO)，游离醛基与Schiff试剂反应生成紫红色产物。【实验用品】(一)试剂：1、过碘酸酒精溶液：取过碘酸（HIO42H2O）0.4g溶于35 m1纯酒精中 ，加入5 m1 的0.2M醋酸钠（醋酸钠2.72g溶于100 m1蒸馏水中），再加入15ml蒸馏水。溶液配好后保存在04的冰箱内，并加黑纸保存，此液如显黄色即失效。2.Schiff试剂：将0.5 g碱性品红加入100m1煮沸的蒸馏水中，时时摇荡玻璃瓶或者搅拌，煮5min，使之充分溶解；然后冷却至50时过滤到具有玻塞的棕色试剂瓶
7、，加入10ml的lmolL的HCl，冷却至25时加入0.5g偏重亚硫酸钠，在室温黑暗条件下静置24h，其颜色呈褐色或淡黄色，加活性炭0.5g剧烈振荡摇匀1min；过滤，滤液为无色。置棕色瓶密封，外包黑纸，4保存。本试剂可提前一天准备，此液必需保持清澈透明、无色也无沉淀，容器要小，装满后仅留很小的空隙，其中不应有任何氧化剂，不要过长时间暴露在空气中。如有白色沉淀就不能再用，如颜色变红可以加入少许偏重亚硫酸钠，使其再转变为无色就可以再用。3、亚硫酸水溶液：取10偏重亚硫酸钠Na2S2O5（或K2S2O5）20ml、1mmolL-1 HCl 20ml和400ml纯水混匀即可。此液使用前配制，否则会因
8、SO2逸出失效。（此液中所用的偏重亚硫酸钠或钾要与Schiff试剂中所用的相同）：4、苏木精溶液常用的有5种，其中德拉菲氏苏木精染液(Delafield 苏木精染液)配法如下:甲液（苏木精5g、无水乙醇30ml）乙液（铵矾，即硫酸铝铵饱和水溶液：比例为1g硫酸铝：11ml水，用时配110ml,取100ml）丙液（甘油125ml、甲醇125ml）。配法如下：1.将甲液一滴一滴地加入乙液中，并随时用玻璃棒搅动；2.然后暴露于阳光和空气中约1周到10天；3.加入丙液；4.将混合液静置2个月至颜色变深为止（可过滤），此液成熟后须置于阴冷处塞紧瓶口，可长期保存使用，使用时可将染剂1份用35份蒸馏水稀释，
9、则染色后分化更明显。、梯度乙醇溶液：100，95，90，80，70，50各两份。一份用于脱腊复水，一份用于脱水。二甲苯7、100%乙醇+二甲苯（1：1）（二)）用具：载玻片 、盖玻片、染色缸、显微镜 、小烧杯、胶头滴管、镊子、刀片 （三）材料：土豆；小鼠肝细胞石蜡切片【实验步骤】（一）土豆切片的观察制作土豆徒手切片 过碘酸处理1530min 70%乙醇 1min schiff试剂 15 min 亚硫酸水漂洗23次 蒸馏水漂洗 镜检（二）小鼠肝细胞切片的观察取鼠肝石蜡切片 二甲苯脱蜡约10min 二甲苯+100%乙醇（3 min）梯度乙醇脱二甲苯，在各浓度乙醇（100，95，90，80，70，5
10、0）中约23 min 过碘酸 氧化1530 min 蒸馏水漂洗 Schiff试剂1530 min 亚硫酸水漂洗23次 蒸馏水漂洗 苏木精染色10 min 流水冲洗梯度乙醇脱水（50，70，80，90，95，100），在各乙醇浓度中约23 min 100%乙醇+二甲苯23 min二甲苯适度透明 指甲油封片 镜检【作业与思考】1、 为所观察到的土豆切片和鼠肝切片绘图，标注其多糖的位置，并描述这两种细胞的多糖分布特点。2、影响PAS反应染色效果的关键步骤是什么？3、如何制作徒手切片？应注意什么才能得到薄而均匀的切片？锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。【注意事项】1.过碘酸氧化作用时间稍长，会使
11、反应更加充分。2.Schiff试剂作用时间略长，会使染色效果明显，但过长将导致染色太深，也不利于观察。3.二甲苯溶解性很强，时间要把握好，前者以脱蜡为准，不要有空气，后者以透明为准。如果片子变黑，重新放回二甲苯，再透明一次。4.试剂重复使用后，实验结果不明显（脱蜡不完全、染色不好等），因此在实验中要检查各试剂是否干净，如果污染严重，一定要更换。实验三 叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法. 2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法. 【实验原理】 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法
12、。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在05的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发
13、出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度,光,淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 【实验用品】 1.器材： 1）主要设备: 普通离心机,粗天平,荧光显微镜；2）小型器材: 剪刀，研钵，移液管，漏斗， 滴管, 10ml刻度离心管,纱布若干, 无荧光载玻片和盖玻片。锲而舍之，朽木不
14、折；锲而不舍，金石可镂。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。2.材料： 新鲜菠菜。 3.试剂： 0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙(acridine orange). 0.01%吖啶橙的配制：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，贮棕色瓶，置4冰箱保存。放冰箱备用，临用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9ml稀释。吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是
15、由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。【实验方法】 1、叶绿体的分离（1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵;（2）加10ml的0.35molL-1 NaCl溶液研磨匀浆;（3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中;（4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀;（5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。2、叶绿体的观察 （1）滴叶绿体悬浮液一滴于载片上，加盖片；在普
16、通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。（2）滴叶绿体悬浮液一滴于无荧光载片上，加无荧光盖片；在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。（3）滴叶绿体悬浮液一滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。3. 完整细胞中的叶绿体观察（1）用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。（2）用镊子撕去菠菜叶子的表皮，用刀片刮下一些叶肉细胞，放于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。（3）将以上两种制片进行一下三种方式的观察：a在普通光镜下观察。b在荧光显微镜下观察。c
17、再滴加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后，在荧光显微镜下观察。【注意事项】要得到完整的、有活性的叶绿体，须低温下迅速提取，涂片后立即观察。【作业与思考】 1. 描述你所观察到的实验现象，自发荧光和次生荧光的区别？2叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？实验四 吖啶橙(acridine orange)染色 观察口腔上皮荧光【目的要求】1、熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。2、观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。【实验原理】吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。
18、【实验用品】1器材：荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签；2材料：口腔黏膜上皮细胞临时制片；3试剂:1)0.1mol/L pH7.0 PBS液。A液：NaH2PO4H20 2.76g加蒸馏水至100ml；B液，Na2HPO47H20 5.36g加蒸馏水至100ml；取A液16.5ml、B液33.5ml、NaCl 8.5g用蒸馏水稀释至100ml。2)0.1吖啶橙原液：0.1g吖啶橙加蒸馏水至100ml。临用时配制0.01吖啶橙染液：将0.1吖啶橙原液用PH7.0 PBS液稀释。3）95乙醇【方法与步骤】1用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上；295乙醇溶液固定5min；3滴加0.01吖啶
19、橙染液染色5min；4用PBS缓冲液缓慢冲洗；5加盖玻片镜检。【观察结果】描述你所观察到的实验现象，并绘图，表明荧光的颜色。实验五 植物细胞骨架的光学显微镜观察【实验目的】掌握植物细胞骨架的制备方法，并用光镜观察洋葱内皮细胞的骨架网络结构。 【实验原理】细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本实验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提
20、掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。 【实验用品】1.器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、擦镜纸、50ml烧杯； 2.实验材料：洋葱鳞茎；3.试剂：1） pH6.8的磷酸缓冲液；索伦森（Sorensen）磷酸缓冲液溶液A：Na2HPO42H2O 11.876g加蒸馏水至1L溶液B：KH2PO4 9.08g加蒸馏水至1L对照下表取一定体积的溶液A，再加入足够的溶液B至总体积达100ml，即得到所需pH的缓冲液。溶液ApH溶液ApH溶液ApH0.64.949.26.881.87.42.35.361.27.085.27.54.95
21、.667.07.188.57.612.16.072.67.293.67.826.46.477.77.396.98.02）M-缓冲液 ：50mmol/L (pH6.7)咪唑、 50mmol/L KCl、0.5mmol/LMgC12 、 1mmol/L EGTA、0.1mmol/L EDTA、1mmol/L巯基乙醇、 4mmol/L甘油、1mol/LHCl调pH至7.2。 3）1%TritonX-100：用M-缓冲液配制。4）3%戊二醛：用pH6.8的磷酸缓冲液配制。5）0.2%考马斯亮蓝R250染液：0.8g考马斯亮蓝R250、46.5ml甲醇、7ml冰醋酸、46.5ml蒸馏水。6）50，70，
22、95乙醇7）叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶【实验步骤】1. 取材：撕取洋葱鳞茎内表皮0.51cm2，浸入装有磷酸缓冲液（PH6.8）的小烧杯中，处理510分钟。2. 去垢处理：弃去PBS缓冲液，用吸水纸吸净剩余的PBS，加适量1%Triton X-100，使液体充分浸泡材料，并立即放入37恒温箱或水浴锅中处理30分钟。3. 冲洗：吸去1%Triton X-100，立即加入M缓冲液轻轻冲洗3次，每次35分钟。4. 固定：用吸管将M缓冲液吸尽，加入3%戊二醛，固定1020分钟。5. 冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用磷酸缓冲液（PH6.8）冲洗3次，每次35分钟。6. 染色：吸去PBS缓冲液，加入适
23、量0.2%考马斯亮蓝R250染料，染色1020分钟。7. 制片：吸去染料，用水冲洗（注意不要将材料丢失）。将洋葱表皮伸展铺平于载玻片上，加盖盖玻片。8. 镜检：将制好的片子置于低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，细胞质内可见到被染成蓝色的粗细不等的分枝状结构，这便是细胞骨架。转高倍镜继续观察，调节细螺旋可见到细胞骨架的立体结构。在有样品的50ml烧杯中，顺序通过如下药物：50、70、95乙醇，95乙醇叔丁醇（1：1），叔丁醇（每级510min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每级510分钟），然后捞取样品，平展于载玻片上，经镜检，效果好的可加一滴中性树胶，盖上盖玻片。【作业与
24、思考】1. 绘出洋葱细胞的骨架网络分布。2根据M-缓冲液的成分，分析其作用。3通过实验过程，推测你所观察到的细胞骨架属于胞质骨架中的哪种类型，为什么？实验六 PEG法诱导细胞融合【实验目的】1. 了解细胞融合的原理和过程；2. 初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。【实验原理】细胞融合，即在自然条件下或利用人工法 (生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。化学融合方法一般使用聚
25、乙二醇(PEG)诱导细胞在体外进行融合。商品PEG的相对分子质量有200-6000范围内的各种规格，它们均可用作细胞融合剂。普遍认为PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的PEG分子量，浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。该方法的优点是：操作简单，容易获得融合体，融合效果好。细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(
26、包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。【实验用品】1器材: 离心机、显微镜、天平、水浴锅、滴管、离心管、烧杯、盖玻片、载玻片。2材料：鸡血悬液；3试剂：1）0.85%的生理盐水；2）GKN液：8.0g的NaCl，0.4g50%（m/V）PEG（37温浴）：取50gPEG（相对分子质量4000）放入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG冷却至5060，勿让其凝固。加入50ml预热至50的GKN液，混匀，置37备用。3）1%詹那斯绿B；4) Hanks溶液（含NaCl，KCl, Na2HPO4, MgSO4, CaCl2, 葡萄糖，酚红）Hanks原液（10）NaCl 80.
27、0gNa2HPO412H2O 1.2gKCl 4.0gKH2PO4 0.6gMgSO47H2O 2.0g葡萄糖 10.0gCaCl2 1.4g称取1.4g的CaCl2，溶于3050ml的重蒸水中。取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧杯中，然后按照上述配方水需，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后，方可放入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已经溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000ml。Hanks液：Hanks原液 100ml重蒸水 896ml0.5酚红 4ml配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4保存。【实验步骤】Hanks溶液换成GKN溶
28、液1.鸡血红细胞悬液的制备：将抗凝剂与鸡血按1:31:4的比例稀释，制成鸡血红细胞细胞悬液，放入4冰箱内可保存3-4天；2.取鸡血1ml，加入4ml0.85%的生理盐水，1000rpm离心3min, 弃上清液，重复上述操作一次；3.沉淀用适量Hanks溶液重悬浮，1000rpm离心3min, 弃上清液，用Hanks溶液稀释沉淀，制成10%左右的细胞悬液，迅速在显微镜下观察细胞密度；4. 取1ml上述细胞悬液，加0.5ml 50% PEG溶液，37水浴中进行细胞融合（30min左右）；5.缓慢加入Hanks溶液，轻轻混匀，终止PEG的作用，使细胞三三两两地分散开来（镜检），室温静置约20min;
29、6.取1小滴悬液于载玻片上，加少量的詹那斯绿B染液，染色5min左右；7.镜检，观察细胞融合现象。【实验结果】1.绘出已融合的细胞形态图，描述你所观察到的细胞融合现象。2.计算细胞融合率。【作业与思考】1请分析Hanks溶液的作用是什么（可以从其成分的角度来回答）？2. PEG诱导细胞融合率受哪些因素影响？3你认为在进行细胞融合时，要注意哪些问题?实验七 动物骨髓细胞染色体标本的制备与观察【实验目的】（1）掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术（2）观察染色体的数目以及形态特征【实验原理】骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度的分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可以直
30、接观察到分裂细胞。经过秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室都可进行。【实验仪器、材料和试剂】1.仪器：天平、低速离心机、恒温水浴锅、显微镜、1ml注射器、解剖盘、解剖剪、刀片。试管架、10ml离心管、吸管烧杯、量筒。酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸2. 材料小白鼠或无尾两栖类青蛙或蟾蜍3. 试剂1）Carnoy固定液（新配制的甲醇：冰醋酸3:1）2）0.1秋水仙素：称取10mg秋水仙素，加入1
31、0ml的0.65生理盐水（1ml含有1000ug，0.1ml含有100ug秋水仙素）；3）0.85%生理盐水；柠檬酸钠溶液；0.4%KCl溶液（0.075M） 4）0.0667mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）A液：1000ml含Na2HPO4 9.465 g或 Na2HPO42H2O 11.876g 或Na2HPO412H2O23.88gB液：1000ml含KH2PO4 9.07g取A液80ml+B液20ml混匀成pH7.45）1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液Giemsa母液：Giemsa粉0.5g，甘油（AR级）33ml，甲醇（AR级）33ml先将少量甘油加入研钵中，将Giemsa粉充分
32、研细，再倒入剩余甘油，并在56温箱中保温2h，然后再加入甲醇混匀，储存在棕色瓶中。【方法与步骤】1.骨髓细胞制备如下表步骤小鼠两栖动物（1）秋水仙素注射按4ug/g体重注射34h后处死按30ug/g注射78h后处死（2）取后肢胫骨和股骨，切去两端。（3）取骨髓细胞2%柠檬酸钠溶液1ml1%柠檬酸钠溶液1ml用1ml注射器吸取柠檬酸钠溶液，通过针头将溶液注入骨髓腔，冲出骨髓细胞置10ml离心管中（细胞冲净后骨髓腔由粉红变为白色）；摘掉针头，用注射器筒轻轻反复吸打，使分散成单个细胞。（4）低渗处理预热及低渗水浴温度：37低渗时间：30min预热及低渗水浴温度：26低渗时间：30min视细胞多少加入
33、79ml 预热的0.4%KCl溶液，在水浴中低渗处理。2. 1000rpm离心8min。3. 弃上清，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸（3:1）固定液5ml，注意不要冲动细胞团块。加完后立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min。如此反复固定23次，每次20min。4 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，细胞团块轻轻吸打成悬液（注意：吹打不要过于用力）。5. 在干净并预冷的载玻片上滴23滴细胞悬液，干燥。（注意：滴片时滴管离载玻片有一定高度有助于染色体分散）6. 将玻片细胞面朝上水平放置，滴加1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液34ml，染色1
34、0min。7. 冲洗掉染液，干燥后镜检。【结果分析】（1）样品的染色体数目是多少？19对常染色体，1对性染色体。共40条（2）要成功制备染色体标本，在操作中应注意哪些问题？【实验提示】过去实验中曾经出现的问题（1）染色后发现没有骨髓细胞原因：未能将细胞从骨髓腔中洗出；离心不慎造成细胞流失；低渗过度造成细胞破裂，染色体流失；冲洗不慎等（2）染色体分散不佳而造成无法计数原因：低渗控制不好造成细胞体积过小；干燥过度等注意：随时镜检才能确定各步骤是否存在问题低渗与离心等步骤的操作要轻。 观察细胞的标准为：1细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。2染色体形态和分布良好。3最好无重叠，即使有个别重
35、叠，也要能明确辩认，以免差错。4所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。 【作业和思考】选择染色体清晰，分散度好的中期分裂相，计数染色体，显微摄影，打印出照片。在制备小鼠骨髓细胞染色体时为什么要进行预固定？因为在之前你得到的染色体都处于不同的分裂期，预固定是为了使这些细胞及其染色体都固定在当前所处的时期，便于观察。其实质就是把细胞杀死，使其无法继续进行有丝分裂。天才是由于对事业的热爱而发展起来的。简直可以说，天才就其本质而论只不过是对事业，对工作的热爱而已。综合大实验：烟草愈伤组织细胞的培养及细
36、胞凋亡的诱导和观察【实验目的】1. 将烟草的悬浮细胞诱导发生细胞凋亡。2. 了解和掌握凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测（DNA梯状条带）。3. 掌握凋亡细胞的形态学观察方法。【实验原理】细胞凋亡被分为两类：受体介导的细胞凋亡和线粒体介导的细胞凋亡。本实验主要涉及线粒体介导的细胞凋亡。凋亡的细胞可用多种方法来检测。凋亡出现时，细胞内源性的核酸内切酶被激活，将染色质DNA自核小体间降解，形成相差180-200bp的大小不等寡核苷酸片段。提取凋亡细胞的DNA，经琼脂糖电泳，分离不同长度的DNA片段，再经溴化乙锭染色，在凝胶成像仪下观察，可见特征性的梯状条带。这就是凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测。【实验步骤
37、】（一）细胞凋亡的诱导1. 48热激烟草悬浮细胞2、4、8小时后，恢复25培养12小时，用于细胞凋亡的检测。2. 4处理烟草悬浮细胞2、4、8个小时后，恢复25培养12小时，用于细胞凋亡的检测。3. 200、400、800ppm的乙烯利处理烟草悬浮细胞12小时后，用于细胞凋亡的检测。（二）凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测实验用品1. 材料：已被诱导凋亡的烟草悬浮细胞2. 试剂：琼脂糖，2CTAB缓冲液（2% CTAB、100mmol/L Tris-HCL(pH8.0)、20mmol/L EDTA(pH8.0)、1.4mol/L NaCL、1% PVP），氯仿，异戊醇，乙醇，异丙醇，液氮3. 仪器：
38、高速冷冻离心机，恒温水浴，电泳装置实验步骤1. 在1.5ml Eppendorf管中，加入500l的2CTAB缓冲液，65预热。2. 10ml离心管10000rpm离心5min悬浮细胞，将离心收集的悬浮细胞放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用灭过菌的不锈钢药勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达0.7ml，混匀后置65水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动离心管。3. 加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀，室温下10000rpm离心10min，移上清至另一新管中。4. 向管中加入1/100体积的RNA酶溶液，37下保温20-30min。（此步骤可酌情略过）5. 加入两部体积的10
39、0%乙醇或0.7倍体积的异丙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30min,12000rpm离心10-15min回收DNA。6. 用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量无菌去离子水中备用。7. 加染色液混合。8. 用1%琼脂糖凝胶电泳检测并观察。注意事项 氯仿 EB有毒，注意使用手套。实验结果 动物凋亡细胞DNA经电泳后出现梯状条带，可以判定细胞出现凋亡。梯状条带是细胞凋亡较晚期的事件，而且只有凋亡细胞在总的细胞中达到一定比例时才出现。植物细胞凋亡状态的呈现散雾状拖尾。（三）凋亡细胞形态学观察实验用品1. 材料：已被诱导凋亡的烟草悬浮细胞2. 试剂：凋亡细胞形态检测试剂盒3. 仪器：显微镜实验步骤
40、（1）凋亡试剂盒检测1. 收集诱导凋亡细胞。2. 用PBS洗涤细胞两次，并调成浓度为1106个/ml细胞悬液。3. Dyes Reagent1染色1）滴细胞悬液于载玻片（提前一天用多聚赖氨酸处理）上，室温晾干，甲醇固定5min。2）在载玻片上滴加一滴Dyes Reagent1室温染色1min，用水轻轻洗去染液。3）在含有体积分数1%盐酸的80%乙醇中分化10秒，流水冲洗，晾干，显微镜下观察细胞的形态。4. Dyes Reagent2染色1）滴细胞悬液于载玻片（提前一天用多聚赖氨酸处理）上，室温晾干，乙醇固定2min。2）在载玻片上滴加一滴Dyes Reagent2（Dyes Reagent2：
41、Buffer A=1：9的混合液）室温染色5-20min，用水轻轻洗去染液。室温晾干。3）二甲苯浸泡3min，封片，显微镜下观察细胞的形态。结果分析Dyes Reagent1处理后的结果：凋亡细胞皱缩，细胞膜完整。染色质凝缩，染成深蓝色，呈环状或新月状附在核膜周围，或细胞核固缩碎裂成数个圆形颗粒，核膜消失。而坏死细胞体积增大，染色质变稀疏呈网状，染成淡蓝色，细胞核破碎，细胞膜不完整。Dyes Reagent2处理后的结果：凋亡细胞皱缩，细胞膜完整。染色质凝缩，染成深紫色，细胞核固缩碎裂成数个圆形颗粒。（2）苏木精、台盼蓝、Gimsa染色检测1. 收集诱导凋亡细胞。2. 用PBS洗涤细胞两次，并调成浓度为1106个/ml细胞悬液。3. 滴细胞悬液于载玻片（提前一天用多聚赖氨酸处理）上，室温晾干，甲醇固定5min。4. 在不同载玻片上分别滴加1-2滴苏木精、台盼蓝、Gimsa，各自室温染色1min，用水轻轻洗去染液。5. 晾干，显微镜下观察细胞的形态。16
