食品生物技术复习资料.docx

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1、 第一章绪论 生物技术定义为“红色生物技术”、“绿色生物技术”和“灰色生物技术”三类。“红色生物技术”是指生物制药技术,“绿色生物技术”是指农业和食品生物技术,而“灰色生物技术”是指工业、环保生物技术。 食品生物技术-现代食品生物技术的作用 一 食品原料和食品微生物的改良，提高食品的营 养价值及加工性能； 二 生产各种功能食品有效成份、新型食品添加 剂； 三 可直接应用于食品生产过程的物质转化； 四 工业化生产预定食品或食品功能成分。第二章基因工程4个问题：1. 什么是基因工程基因工程的概念在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞

2、去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程.由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。2. 为什么能进行基因工程基因工程的原理和技术（涵盖3大理论和3大技术准备）四基因工程3大理论，3大技术准备：（一）理论上的3大发现：1. 20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。2. 20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。3.

3、20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNARNAPr,破译了全部遗传密码，43。1“基因剪刀”限制性内切酶的发明2载体(“交通工具车子”)将质粒作为基因工程载体使用3逆转录酶3.怎样进行基因工程3大步骤（DNA体外重组，重组DNA如何进行扩增和表达，基因工程后处理）4. 基因工程的应用和前景（一）基因（gene） 基因-从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。（二）基因工程（genetic engineering） 基因工程 -在体外通过人工剪、接

4、，将不同来源的DNA分子 组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后 导入宿主细胞去复制扩增或表达。 因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。 由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。 基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。 在这个过程中： 1.“基因剪刀” 剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起 3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因 （二） 技术上的3大发明： 1“基因剪刀”限制性内切酶的发明 （1）20世纪4060年代，科学家们就为基因工程设计了美好的

5、蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。 （2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。 （3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了Hind，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。 2载体(“交通工具车子”)基因工程技术诞生的第二个技术准备 （1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子-将重组DNA送到宿主细胞中去。 （2）1946年起，Lederberg

6、就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。 （3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。 3逆转录酶1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（为什么） (1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，13kb/基因，104，2.2*1011公里。 （2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mR

7、NA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。 （3）经过逆转录mRNAcDNA (complementory DNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。 有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。 第二节 基因工程的酶学基础常用的工具酶（tool enzymes）有： 1.限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease)-定义，分类，命名1.定义 一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。并切割dsDNA

8、。2.分类 限制酶都是从原核生物中发现的（400多种E/350M）。所有的限制酶可分成3类。 （1）、型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说型识别核苷酸切割的位点一致，但罕见）。 （2）型 基因工程说到的限制酶是型酶，具有此类酶的微生物限制修饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。型酶分子量小，仅需Mg2作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段。3. 命名（1973年Smith 原则、型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写 该微生物种名前的

9、2个字母第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母罗马字母、 从一种微生物中发现了几种限 制酶，按发现顺序排列2.DNA连接酶（DNA ligase, ligase)功能、影响连接酶作用的因素、连接方法（一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。 （二）来源噬菌体T4感染E.coli分离的一种单链多肽酶、MW. 68KD。 （三）催化反应： （1）需要ATP、Mg2+作辅助因子； （2）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100） 体外连接的几种方

10、式： 1. 用连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 2. 用连接酶将平末端的DNA片断连接； 3. 用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断 加上poly(A)- poly(T)尾巴之后，再用连接 酶连接。 4. 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形 成粘性末端后，再用连接酶连接 影响连接酶作用的因素 1. 反应温度： 连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度： 415度 2.连接酶的用量： 平末端DNA分子的连接反应中，最适12个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位 ATP的用量10mol-1mmol/L之间 3. 提高外源片断与载体的浓度的比值（

11、1020倍）粘性末端DAN片断的连接 由于具粘性末端的载体易发生自连。 对载体的5末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。 而外源片断的5-P能与载体的3-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5-P的链不能进行连接，形成3- OH 和5- OH 的缺口。平末端DNA片断的连接 1）. T4DNA连接酶 2）. 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾 巴之后，再用DNA连接酶连接。衔接物连接法 平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子D

12、NA，约1020个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。DNA接头（adapter）连接法： 它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。 粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5-P，暴露出5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。3.DNA聚合酶(DNA polymerase, DNA pol) 定义把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链D

13、NA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)-该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。 以1. 和2. 最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。第三节 载体载体的概念：1.要把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或

14、克隆DNA片段统称为vector。3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA基因工程载体的3个特点（一）能独立自主的复制 载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。 （二）能便利的加以检测 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。 （三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。噬菌体载体-噬菌体结构特点： 1、野生型为48.5kb，两

15、端带有12碱基的单链粘性末端，进入 大肠杆菌后环化，既可溶菌又可溶原生长。 2、基因组分为三个区域：左侧区包括使噬菌体成熟的全部基 因；中间区不是病毒生活必需的，外源DNA片段往往插入 此区；右侧区包括所有的主要调控成分。 3、-噬菌体基因组中只有60%是溶菌生长必需的，作为克 隆载体时，可插入923kb的外源DNA片段质粒载体(1) 染色体外的双链环状DNA分子(2)大小为1200kb；()能独立于染色体外进行自我复制，每个细胞中 可含10200个拷贝。(4)分高拷贝数和低拷贝数质粒或窄宿主范围和广宿 主范围 (5)质粒包含：复制起始区、选择标记基因和限制性 核酸内切酶的酶切位点常用质粒有：

16、pBR322、pUC19质粒的不相容性：同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象 3.柯氏质粒粘尾质粒(cosmid)柯氏质粒定义: 含有入噬菌体粘性末端的复合质粒。 由入-DNA c o s区与质粒重组建造而成. 在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。含有质粒的抗药性标记如Ampr基因或Tetr基因及自主复制成分，所以这种粘性质粒可以在细菌中大量复制扩增。当体外重组的粘性质粒分子包装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌后，可按质粒的方式进行复制。带有噬菌体的粘性末端(cos区)。这一粘性末端是体外包装系统必不可少的成分，所以它可以像噬菌体一样进行体

17、外包装。具有一个或多个限制酶的酶切位点。其本身分子量小，如pHC79仅6.5kb，可容纳40kb左右的DNA片段。由于非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而体外包装的主要是重组体，有利于以后的筛选。 第四节 基因工程技术与方法基因工程包括3个步骤：1 DNA重组DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤2 重组DNA导入宿主细胞克隆扩增或表达3 基因工程的后处理（downstream techniques of GE）重组DNA技术的基本过程：1 载体

18、的选择和制备分；2 制备目的基因片段切；3 DNA片段的重组连接接；4 重组DNA导入受体细胞转；5 转化子的筛选筛；6 重组子的筛选筛；1利用表型特征进行筛选2. 物理筛选3. 酶切鉴定4. 核酸杂交5. PCR鉴定6. 免疫学方法7. 利用western杂交8 利用序列测定转译筛选1. 基因组文库法-定义、如何构建将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因基因文库如何构建？将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每

19、个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。 2.CDNA文库法-定义、如何构建如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。cDNA：指体外用逆转录酶催化，以mRNA为模板合成的互补DNA。cDNA:汇集某生物成熟mRNA为模板逆转录而成cDNA序列的的重组群体噬菌体和质粒为载体构建在什么情况下我们选用cDNA文库法来制备目的基因?操作程序）总RNA的提取；注意抑制酶的活性，盐酸胍，二乙基焦碳酸）mRNA

20、的分离：选用高度分化的组织，末端带有poly A.）cDNA双链的合成： poly A RNA为模板）cDNA与载体的连接）噬菌体的包装以及转染或质粒的转化1. 表型特征进行筛选a. 根据载体表型特征的筛选 抗药性标记插入失活法 -半乳糖苷酶显色反应筛选法b. 根据外源提供的遗传性状的筛选c. 利用噬菌斑的形成d. 利用遗传互补作用第六节 克隆基因与表达系统 一、基因工程的目的和主要工作 （一）基因工程的目的有: 1.生产基因工程的产品。 2.改良生物的性状, 对人来说是开展基因治疗。 （二）根据克隆基因和宿主细胞的不同,基因工程的工作可以分成: 1. 克隆真核基因在真核系统表达,如开展基因治

21、疗 2.克隆真核基因在原核系统表达,如生产基因工程的 产品。 3.克隆原核基因在原核系统表达。 4.克隆原核基因在真核系统表达。 由于人类赖以生存的生物类群与真核关系密切,而原核生物的繁殖优势是任何真核生物都无法比拟的,所以除了开展基因治疗外, 基因工程的主要工作是克隆真核基因在原核系统表达。外源基因在原核生物中正确表达的基本条件 启动子概念启动子 -DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子. TATAAT(pribnow

22、box) 为RNA聚合酶结合位点， TTGACA是识别位点。这两个区域是决定启动子强度的重要因素. 序列概念在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游310 bp处的由39 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。 它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后

23、，才能产生一个完整的蛋白质。 起始密码子-概念AUG（甲硫氨酸）GUG（缬氨酸），也就是翻译过程中，所合成多肽的第一氨基酸应是甲硫氨酸或缬氨酸 终止子-概念在一个基因的末端往往有一段特定顺序，它具有转录终止的功能，这段终止信号的顺序 转译后的修饰和加工-概念1.细菌RNApol不能识别真核的promotor,故真核基因不能被该酶转录.2.从真核转录的mRNA缺乏SD序列,不能结合到细菌核糖体rRNA,因此不能被翻译成蛋白.3.真核基因有内含子,而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统,成熟的mRNA不能形成,不能表达真核蛋白 ;4.表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定,易被细菌蛋白酶降解.将真核基因克

24、隆到1个强大的原核promotor和SDs的下游,使真核基因处于原核启动子的控制之下,转录物由于原核SDs能与核糖体rRNA结合,可在原核表达.这是克服1,2困难的好办法.克服3,4 从真核分离出mRNA并逆转录成cDNA,cDNA有完整的编码顺序,但无内含子,这是解决第三个困难的方法,第四个困难解决的方法是采用伪装办法将真核基因插到原核基因某密码之后,其翻译产物N端有原核多肽,这样表达的融合蛋白,可躲避细菌蛋白酶降解作用.第八节 基因工程在食品工业应用现状 一 基因工程与动物植物微生物产品品质 的改良 二基因工程与植物产品储藏保鲜 三基因工程与食品新资源的开发基因工程与植物产品储藏保鲜原理

25、基因工程 合成酶基因工程 乙烯形成酶基因工程 脱氨酶基因工程1. 基因工程要点:PG基因-多聚半乳糖醛缩酶是果实成熟过程中新合 成的 一种蛋白质.具有降解细胞间果胶质量的作用,对果实软化有很大影响. 两条75bp的长引物进行PCR反应，扩增出甜瓜PGl基因的128bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体中，筛选反向克隆，然后将其反向构建到植物表达载体pUC38-ACC的CaMV35S启动手和TMV增强子“”的下游，构建成反义表达载体pUC38-PGo用PCR鉴定重组子. 重组子PG活性降低，抗裂，抗机械损伤，不易感染。 2. 合成酶基因工程 合成酶是一种以磷酸吡哆醛为辅酶的酶，在乙烯生物合成中

26、起到关键作用。 用基因工程的方法将ACC还原酶和ACC氧化酶的反义基因和外源的ACC脱氨酶基因导入正常植株中，获得乙烯缺陷型植株，达到控制果实成熟的目的，已在番茄中实现。乙烯在果实成熟中的作用：能使果实呼吸性强度大大提高，并能提高果实组织原生质对氧的渗透性，促进果实呼吸作用和有氧参与的其它生化过程 使果实中酶的活动性增强并改变酶的活动方向，从而大大缩短了果实成熟的时间。而1-氨基环丙烷-羧酸（ACC)是乙烯生物合成的直接前体。 3.乙烯形成酶（ACC氧化酶,EFE)基因工程-是乙烯生物合成途径中最后一个酶。构建EFE的反义RNA抑制EFE的活性。4.脱氨酶基因工程-ACC脱氨酶能把ACC降解为

27、-酮基丁酸和氨，其中，-酮基丁酸是植物体内正常代谢产物，也是乙酰乳酸合成酶的底物。 ACC脱氨酶基因可使任何一种植物体内的乙烯合成能力降低 第三章 发酵工程原理及其在食品工业中的应用第一节 发酵工程概况 一 发酵工程的定义1. 发酵的定义: 借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身, 或其初级代谢产物或次级代谢产物的过程2. 发酵工程: 利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术，又称微生物工程. 生物技术走向产业化的必经之路.不同碳源的利用速度 不同菌能利用的碳源不同，同一菌种对不同碳源利用速度不同。 如：青霉素产生菌利用葡萄糖快（30-40小时），利用乳糖速度

28、慢（6天）。 一般情况：单糖比双糖快；双糖比多糖快；纯多糖比杂多糖快（淀粉最好）。 快者为速效碳源，迅速参与菌体生长代谢和产生能量适于长菌 慢者为迟效碳源。利于延长代谢产物的合成发酵工业中常用的原料 消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率 能产生最高的产品或菌体的浓度 能以最大的速率产生产物 副产品的得率最小 价廉并具有稳定的质量 来源丰富且供应充足 易于通气和搅拌 提取、纯化、废物处理等生产工艺过程都比较容易生长因子 从广义来说，凡是微生物不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。 其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。 生长因子不是所有微生物都必需的

29、，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。 目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。提供生长因子的农副产品原料1) 玉米浆2) 麸皮水解液3) 糖蜜4) 酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。前体物质某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较大的提高。有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率。氨基酸发酵的前体物质氨基酸菌体前体物质产量/%丝氨酸嗜甘油棒状杆菌甘氨酸1.6色氨酸异常汉逊酵母氨茴酸0.8色氨酸麦角菌吲哚1.3蛋氨

30、酸脱氢极毛杆菌2-羟基4-甲基硫代丁醇1.1异亮氨酸粘质赛杆菌-氨基丁酸0.8异亮氨酸阿氏棒状杆菌D-苏氨酸1.5苏氨酸谷氨酸小球菌高丝氨酸2.0第三节 培养基的灭菌 灭菌：利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。 消毒：用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽胞。 消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。 只有不受杂菌污染，发酵过程才能正

31、常进行。 干热灭菌法进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对于热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160170、11.5h。实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。 火焰灭菌法 利用火焰直接杀死微生物的灭菌法称为火焰灭菌法。该法方法简单，灭菌彻底，但使用范围有限，仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。 电磁波、射线灭菌法 利用电磁波、紫外线、X射线、射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌，以紫外线最常用。 紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用，但细菌

32、芽胞和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。 紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌，对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。 250270nm之间杀菌效率高，以波长在260nm左右灭菌效率最高。 除紫外线外，X射线和射线也可进行灭菌。湿热灭菌法（主要是高压蒸汽灭菌）利用饱和蒸汽进行灭菌原理：水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，高压情况下可获得高温的水蒸汽。借助蒸汽的高温和蒸汽释放的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡从灭菌效果来看，由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽胞杆菌来说，温度升高10时，灭菌

33、速度常数可增加810倍，对营养细胞更高。另外蒸汽冷凝为水时还要释放出潜热，因此温度可进一步提高蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠湿热灭菌法是目前最常用的灭菌方法，一般的湿热灭菌条件为121，30min化学药剂灭菌法某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用。化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。湿热灭菌的原理1. 微生物的热阻每一种微生物都有一定的最适生长温度范围，当微生物处于最低限温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质体和酶的基本成分蛋

34、白质发生不可逆的变化，即凝固变性，使微生物在很短时间内死亡。湿热灭菌就是根据微生物的这种特性进行的l 一般无芽胞细菌，在60下经过10min即可全部杀死；l 芽胞细菌的芽胞在100下经过几分钟至数小时才能杀死；l 某些嗜热菌能在120下耐受2030min。l 一般讲，灭菌的彻底与否 以 能否杀死芽胞细菌为标准。高温瞬时灭菌法原理p 由于灭菌时的活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E，因此，随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数培养基中营养成分分解的速率常数的增加倍数。即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高，超过了培养基营养成分破坏的速度。p 据测定，每升高10，速率常数的增加倍数为Q10。一般

35、化学反应Q10为1.52.0；杀灭芽胞的反应Q10为510；杀灭微生物细胞的反应Q10为35左右。p 在热灭菌的过程中，同时发生微生物死亡和培养基成分破坏两个过程。p 温度能加速其过程进行的速度，当温度升高时，微生物死亡的速度更快，p 因此可以采用较高的温度，较短的灭菌时间，以减少培养基营养成分的破坏，这就是通常所说的“高温瞬时灭菌法”。过滤除菌法第四节 菌种的活化与扩大培养 活化与扩大培养: 将保存的处于休眠状态的生产菌种接入到试管斜面活化后,再经过茄子瓶或摇瓶以及种子罐逐步扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程.生产车间种子制备1.种子罐种子制备 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，

36、一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 1) 孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子. 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。 2) 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子. 将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。 种子罐级数的确定 依据: 菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用 种子制备目的: 形成一定数量和质量的菌体。发酵的目的: 获得大量的发酵产物 产物是在菌体大量形成 并达到一定生长阶段后形成的， 需要在大型发酵罐内

37、才能进行。同时若干发酵产物的产生 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此，将 两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐 内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。 种子罐级数减少，有 利于生产过程的简化及发酵过程的 控制，可以减少因种子生 长异常而造成发酵的波动。 种龄种龄: 种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐 的培养时间 接种量定义: 移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例发酵罐的接种量大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。 制霉菌素发酵的接种量为0.11 肌苷酸发酵接种量1.52 霉菌的发酵接种量一般为10， 多数抗生素发酵的接种量为

38、715，有时可加大到2025。 例如，生产制霉菌素时用1的接种量，其效果较用10的为好，而0.1接种量的生产效果与1的生产效果相似。种子质量标准 发酵工业生产上常用的种子质量标准 细胞或菌体菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观。菌体形态可通过显微镜观察来确定，以单细胞菌体为种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。 菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。 生化

39、指标种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况及变化为指标 产物生成量种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映。 酶活力测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。 如土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。 此外，种子应确保无任何杂菌污染。 种子异常的分析 在生产过程中，种子质量受各种各样因素的影响，种子异常的情况时有发生，会给发酵带来很大的困难。种子

40、异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。 菌种生长发育缓慢或过快菌种在种子罐生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。生产中，通入种子罐的无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。生产中，培养基灭菌后需取样测定其pH值，以判断培养基的灭菌质量。 菌丝结团 在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。这时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵产生显著影响。如果菌丝团较多，种子液移入发酵罐

41、后往往形成更多的菌丝团，影响发酵的正常进行。菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关，一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。 菌丝粘壁 菌丝粘壁是指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上。其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。以真菌为生产菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。 第五节 发酵工艺过程控制n 发酵过程中的代谢变化与控制参数 分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵及连续发酵的定义n 温度对发酵的影响及其控制n pH值对发酵的影响及其控制n 溶解氧对发酵的影响及其控制n 菌体浓度和基质对发酵的影响及其控制n 补料的控制-料分批培养（FBC）的优点、补料的方式n 泡沫对发酵的影响及其控制n 发酵终点的判断n 发酵过程检测与自控应用微生物生产单细胞蛋白一、 发酵法生产单细胞蛋白 概念：利用各种基质大规模培养细菌、酵母菌、霉菌、微藻、光合细菌等 而获得的微生物蛋白应用：作为现代饲料工业和食品工业中重要的蛋白来源。SCP营养丰富： 1）蛋白质40%80% 2）多种维生素 3）碳水化合物 4）脂类 5）酶类和生物活性物质：辅酶A、辅酶Q、谷胱苷肽、麦角固醇 6）矿物质 7）氨基酸组成齐全，人体必需8种氨